毛木耳958對(duì)4種抗生素的敏感性研究

杜春梅 柏廣波 董錫文

摘要 [目的]檢測(cè)毛木耳958對(duì)青霉素、硫酸鏈霉素、制霉菌素和卡那霉素 4 種抗生素的敏感性，以尋找適合原生質(zhì)體融合育種的抗性篩選標(biāo)記。[方法]以毛木耳958為試驗(yàn)材料，在PDA培養(yǎng)基中加入不同濃度的抗生素，測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速率、菌落形態(tài)特征和鎖狀聯(lián)合菌絲數(shù)量。[結(jié)果]適宜濃度的青霉素和硫酸鏈霉素對(duì)毛木耳958菌絲生長(zhǎng)都有顯著的促進(jìn)作用，而制霉菌素和高濃度的卡那霉素對(duì)菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制作用；4 種抗生素對(duì)毛木耳958菌落形態(tài)特征影響較小；青霉素、制霉菌素和卡那霉素高于 300 μg/mL 時(shí)，毛木耳958鎖狀聯(lián)合菌絲比率呈明顯的下降趨勢(shì)，硫酸鏈霉素對(duì)其無(wú)顯著作用。[結(jié)論]毛木耳958對(duì)制霉菌素和高濃度的卡那霉素具有較強(qiáng)的敏感性，做篩選標(biāo)記時(shí)控制好抗生素的濃度，盡量減少其對(duì)鎖狀聯(lián)合菌絲比率的影響。

關(guān)鍵詞 毛木耳958；抗生素；敏感性；菌絲；鎖狀聯(lián)合

中圖分類(lèi)號(hào) S646.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）23-0033-02

Abstract [Objective] To study the sensitivity of Auricularia polytricha 958 to penicillin，streptomycin sulfate，nystatin and kanamycin，as well as to find the resistance screening markers suitable for protoplast fusion breeding.[Method] Taking Auricularia polytricha 958 as the material，growth rate of mycelia，morphological features of colony and clamp connection amount of mycelia were determined by adding different concentrations of four kinds of antibiotics in PDA media.[Result] Growth rate of mycelia were promoted significantly by a proper concentration of ampicillin and streptomycin sulfate.But growth rate of mycelia were inhibited significantly by nystatin and the higher concentration of kanamycin.The effects of four antibiotics on the colonial morphological characteristics of the stain were not significantly.The ratios of hyphal clamp connection of Auricularia polytricha 958 were decreased when the concentration of penicillin，nystatin and kanamycin were higher than 300 μg/mL.The effect of streptomycin sulphate on forming of clamp connection was not significant.[Conclusion] The sensitivities of Auricularia polytricha 958 to nystatin and the higher concentration of kanamycin were obvious.Thus，the concentration of antibiotics should be controlled when it was used to screening marker，and minimize the effect of the antibiotic on ratio of hyphal clamp connection.

Key words Auricularia polytricha 958；Antibiotics；Sensitivity；Mycelia；Clamp connection

毛木耳屬于木耳目，木耳科，木耳屬中的毛木耳種（Auricularia polytricha）[1]，是世界性的重要栽培品種之一，主要生長(zhǎng)在中國(guó)的南方和一些東南亞國(guó)家[2-3]。毛木耳含有豐富的鎂元素，其抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高、價(jià)格低廉，但品性差、質(zhì)地硬而脆[4-5]。對(duì)毛木耳和嫩滑、味好、鐵元素含量較高、商品性好的黑木耳進(jìn)行原生質(zhì)體融合，有可能篩選出具有雙親優(yōu)良性狀的木耳新種。但利用哪種篩選標(biāo)記來(lái)篩選融合子是育種工作者面臨的瓶頸。抗藥性標(biāo)記是篩選融合子的較好手段，微生物抗藥性由菌種遺傳物質(zhì)決定，遺傳上十分穩(wěn)定[6]。用抗藥性差異選擇融合子時(shí)要把握好藥物的濃度，過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響融合子的檢出。毛木耳958是山東省廣泛栽培的一個(gè)毛木耳品種，其出耳溫度20～36 ℃，具有極強(qiáng)的抗霉能力，耳片大且肉厚，總產(chǎn)量高，用純玉米心種植0.5 kg干料可以產(chǎn)出干耳90～125 g，是用于融合育種的重要備選菌種之一。鑒于此，筆者初步測(cè)定了毛木耳958對(duì)4種不同濃度梯度抗生素的敏感性，以期找到合適的遺傳篩選標(biāo)記，為木耳的原生質(zhì)體融合育種研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。毛木耳958斜面菌種購(gòu)于山東省濟(jì)寧市永騰食用菌研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g，水1 000 mL，pH 5.8[7]。

抗生素-PDA培養(yǎng)基：在PDA培養(yǎng)基中加入不同濃度抗生素，包括青霉素-PDA培養(yǎng)基，硫酸鏈霉素-PDA培養(yǎng)基，制霉菌素-PDA培養(yǎng)基和卡那霉素-PDA培養(yǎng)基等。

1.1.3 試劑。青霉素（80萬(wàn)單位，國(guó)藥準(zhǔn)字H31020929，華北制藥股份有限公司），硫酸鏈霉素（10萬(wàn)單位，國(guó)藥準(zhǔn)字H37022586，瑞陽(yáng)制藥有限公司），制霉菌素片（50萬(wàn)單位，國(guó)藥準(zhǔn)字H330211393，浙江震元制藥有限公司），卡那霉素（20萬(wàn)單位，國(guó)藥準(zhǔn)字H37020562，齊魯制藥有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 抗生素母液的配制。

將4種抗生素制備成50 mg/mL抗生素母液，用0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌后于4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 培養(yǎng)基的制備。

PDA培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備。抗生素-PDA培養(yǎng)基是在PDA培養(yǎng)基中加入不同體積的抗生素母液，使其終濃度分別為50、100、200、300、400和500 μg/mL。

1.2.3 菌種的活化及接種。

將供試斜面菌種放入25 ℃的培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24 h后，用接種鏟接種到PDA平板上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)8 d。在菌落周邊取直徑為0.65 cm健壯的菌絲塊，用接種鏟轉(zhuǎn)接到制備好的抗生素-PDA培養(yǎng)基平板中央。同時(shí)用鑷子夾取潔凈的已滅菌的蓋玻片傾斜45°插入培養(yǎng)基中，蓋玻片距離接種塊2 cm，每個(gè)平板插入3個(gè)蓋玻片，置于25 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。每個(gè)變量設(shè)6個(gè)重復(fù)，其中3個(gè)重復(fù)觀察菌絲體生長(zhǎng)速率及外觀特征，另外3個(gè)重復(fù)用于顯微鏡下觀察，以上均以無(wú)抗生素的PDA培養(yǎng)基作空白對(duì)照。

1.3 觀察及測(cè)定

1.3.1 菌絲體外觀特征。

每天用游標(biāo)卡尺測(cè)量培養(yǎng)中的毛木耳958的菌落直徑，連續(xù)測(cè)量9 d，計(jì)算平均日長(zhǎng)速及抑制率。菌絲平均日長(zhǎng)速（cm/d）=（菌落直徑-接種塊直徑）/（2×天數(shù)）。抑制率（%）=[（對(duì)照菌絲生長(zhǎng)速率-抗生素處理菌絲生長(zhǎng)速率）/對(duì)照菌絲生長(zhǎng)速率]×100[8]。同時(shí)觀察菌絲組織外觀特征，包括萌發(fā)時(shí)間，菌絲色澤、密度、長(zhǎng)勢(shì)，菌落邊緣，褐變程度，隆起狀況等。

1.3.2 顯微觀察。

待毛木耳958菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)蓋玻片，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)取出，置于10×40倍顯微鏡下觀察記錄菌絲鎖狀聯(lián)合形成情況，計(jì)算鎖狀聯(lián)合菌絲比率。菌絲鎖狀聯(lián)合比率=鎖狀聯(lián)合個(gè)數(shù)/菌絲數(shù)[9]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗生素培養(yǎng)基對(duì)毛木耳958菌絲平均日長(zhǎng)速的影響

由表1可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，青霉素對(duì)毛木耳958菌絲生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用（P<0.05）。隨著青霉素濃度的升高，促進(jìn)作用先強(qiáng)后弱。當(dāng)青霉素濃度為100 μg/mL時(shí)，促進(jìn)作用最強(qiáng)，生長(zhǎng)速率與對(duì)照相比提高了13.00%；濃度為100～300 μg/mL時(shí)，硫酸鏈霉素對(duì)毛木耳958的生長(zhǎng)促進(jìn)作用最強(qiáng)且無(wú)差異顯著性（P>0.05）；濃度大于300 μg/mL時(shí)，出現(xiàn)了明顯的抑制作用，但抑制率不超過(guò)5%；制霉菌素對(duì)毛木耳958有明顯的抑制作用，并且濃度越高抑制作用越強(qiáng)，抑制率高達(dá)40%；濃度在300 μg/mL范圍內(nèi)，卡那霉素對(duì)毛木耳958的生長(zhǎng)影響不顯著，高于此濃度開(kāi)始出現(xiàn)抑制作用，且抑制作用顯著增強(qiáng)。

2.2 不同抗生素培養(yǎng)基對(duì)毛木耳958菌落形態(tài)特征的影響

在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，各培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛木耳958菌絲的萌發(fā)時(shí)間大多數(shù)為48 h。含青霉素和制霉菌素的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲體外觀形態(tài)特征與對(duì)照菌株相比無(wú)顯著變化，但色素產(chǎn)量略有增加；硫酸鏈霉素-PDA培養(yǎng)基上菌絲體較稀疏，色素產(chǎn)量較對(duì)照菌株有顯著增加；卡那霉素-PDA培養(yǎng)基上菌絲體較稀疏，其他特征無(wú)明顯區(qū)別。

2.3 不同抗生素培養(yǎng)基對(duì)毛木耳958鎖狀聯(lián)合菌絲比率的影響

從圖1可以看出，隨著硫酸鏈霉素濃度的升高，毛木耳958鎖狀聯(lián)合菌絲比率不顯著的增加趨勢(shì)（P>0.05）；青霉素、制霉菌素和卡那霉素在低濃度時(shí)，該比率略高于不加抗生素培養(yǎng)的對(duì)照菌株，且差異不顯著。高于300 μg/mL時(shí)，該比率呈明顯的下降趨勢(shì)（P<0.05）。

3 結(jié)論與討論

自從1972年Devriers等人對(duì)裂褶菌原生質(zhì)體制備成功開(kāi)始，原生質(zhì)體融合技術(shù)已運(yùn)用到食用菌研究領(lǐng)域[10]。原生質(zhì)體融合育種遺傳信息傳遞量大，不需詳細(xì)了解雙親的遺傳背景，可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交；該方法操作方便，適用性強(qiáng)，為食用菌新種的選育提供了廣闊的發(fā)展前景[11]。

近年來(lái)，融合子篩選方法不斷涌現(xiàn)，如利用抗藥性選擇融合子，馬玉銀等[12]采用一定濃度的NaNO3選擇再生培養(yǎng)基對(duì)佛羅里達(dá)側(cè)耳與姬菇融合后代進(jìn)行篩選得到一株雙親融合菌株。王淑珍等[13]利用食用菌對(duì)潮霉素的自然抗性篩選香菇和松茸的融合子。用抗藥性差異選擇融合子時(shí)要控制藥物的濃度，濃度過(guò)低則親本生長(zhǎng)過(guò)快，影響融合子的檢出；濃度過(guò)高則融合頻率降低[6]。該研究結(jié)果顯示，一定濃度的青霉素和硫酸鏈霉素對(duì)毛木耳958菌絲生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，菌落外觀特征與對(duì)照菌株相比沒(méi)有發(fā)生明顯的變化；在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，毛木耳958對(duì)制霉菌素和高濃度的卡那霉素有極強(qiáng)的敏感性，菌絲生長(zhǎng)受到顯著抑制，這與筆者前期對(duì)黑木耳的研究結(jié)果類(lèi)似[14]。鎖狀聯(lián)合是黑木耳菌絲生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中明顯的指示特征，可作為自然遺傳標(biāo)記。肖在勤等[15]利用雙親都具有鎖狀聯(lián)合的雙核異核菌絲體為親本，進(jìn)行鳳尾菇與金針菇科間的原生質(zhì)體融合，并結(jié)合融合核分裂技術(shù)篩選融合子。該研究結(jié)果顯示，青霉素、制霉菌素和卡那霉素高于300 μg/mL時(shí)，都能顯著降低鎖狀聯(lián)合菌絲的比率。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，菌絲日生長(zhǎng)速率與鎖狀聯(lián)合菌絲比率之間呈極顯著的正相關(guān)性。由此可以得出，制霉菌素或高濃度的卡那霉素能抑制毛木耳958的生長(zhǎng)速率，可考慮作為育種的抗性篩選標(biāo)記，但做篩選標(biāo)記時(shí)應(yīng)控制好抗生素的濃度，盡量減少其對(duì)鎖狀聯(lián)合菌絲比率的影響。

參考文獻(xiàn)

[1]張丹，鄭有良.毛木耳（Auricularia polytricha）的研究進(jìn)展[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，17（5）：668-673.

[2] 趙爽，布達(dá)，劉宇，等.毛木耳菌絲體營(yíng)養(yǎng)優(yōu)勢(shì)菌株的篩選研究[J].中國(guó)食用菌，2011，30（5）：8-9.

[3] VEERALAKSHMI S，AHILA DEVI P，PRAKASAM V，et al.Molecular characterization and standardization of cultivation for wood ear mushroom[Auricularia polytricha（Mont.）]Sacc.[J].International journal of biotechnology research，2014，2（5）：60-64.

[4] 楊新美.關(guān)于進(jìn)一步發(fā)展我國(guó)食用菌事業(yè)的商討[J].中國(guó)食用菌，1991（1）：3-5.

[5] 呂文英.黑木耳和毛木耳中無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素含量的測(cè)定與研究[J].微量元素與健康研究，2007，24（4）：30-31.

[6] 曹文芩，郭順星，徐錦堂.大型真菌原生質(zhì)體融合技術(shù)研究進(jìn)展[J].生物學(xué)通報(bào)，1998，33（10）：2-4.

[7] 李秀霞.生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)：下冊(cè)[M].沈陽(yáng)：東北大學(xué)出版社，2013.

[8] 張國(guó)廣，黃家福，陳麗萍，等.靈芝菌絲體對(duì)4種抗生素的敏感性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（14）：7701-7702，7719.

[9] 王妍，杜春梅，姜忠元，等.不同培養(yǎng)基對(duì)黑木耳鎖狀聯(lián)合菌絲比率的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（35）：49-50.

[10] 張?zhí)鹛穑瑥堉沃校瑥埬?食用菌原生質(zhì)體融合育種技術(shù)的研究進(jìn)展（綜述）[J].浙江食用菌，2009，17（3）：29-31.

[11] 王春暉.食用菌領(lǐng)域原生質(zhì)體技術(shù)研究應(yīng)用淺析[J].中國(guó)食用菌，2011，30（3）：3-5.

[12] 馬玉銀，顧慶龍.側(cè)耳屬種間原生質(zhì)體融合雜種選育的研究[J].食用菌學(xué)報(bào)，1994，1（1）：17-21.

[13] 王淑珍，白晨，高雁，等.松茸與香菇原生質(zhì)體融合的研究[J].食用菌，2003，25（2）：9-10.

[14] 甄文爽，董錫文，杜春梅，等.4種抗生素對(duì)黑木耳黑29菌絲生長(zhǎng)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（33）：57-59.

[15] 馬玉銀，李霖.原生質(zhì)體技術(shù)在食用菌遺傳育種中的應(yīng)用[J].中國(guó)野生植物資源，2000，19（6）：1-4.