響應面法優化仙人掌酵素的發酵工藝

張良 劉媛潔 包珍 肖勇生

摘要 [目的]利用酵母菌和乳桿菌發酵仙人掌制備仙人掌酵素。[方法]首先以糖的添加量、菌種比例、接種量、發酵溫度、發酵時間為因素進行單因素試驗，確定超氧化物歧化酶（SOD）活性較大時各因素相應的范圍；然后分析試驗條件，應用Box-Behnken中心組合設計，以糖的添加量、接種量和發酵溫度為因素，以SOD活力的變化為響應值進行試驗，運用SAS統計軟件對試驗數據進行分析，建立二次響應面回歸模型，得出重要因素的最佳水平，從而確定最佳的發酵條件。[結果]經響應面法優化獲得仙人掌酵素發酵工藝的參數如下：糖的添加量55.0%、接種量4.0%、發酵溫度34.0 ℃，在優化條件下，SOD活力達到323.21 U/g。 [結論]該研究可為仙人掌酵素的生產提供科學依據。

關鍵詞 仙人掌；酵素；發酵；響應面法

中圖分類號 TS201.3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）17-0170-03

Abstract [Objective]To prepare cactus enzyme by fermentation of cactus with yeast and lactobacillus. [Method]The influence of additive amount of sugar，proportion of species，inoculation amount，fermentation temperature and fermentation time on SOD enzyme activity producing by cactus fermentation were studied through single factor experiment，and approximately determined the amount of the various factors.Then the additive amount of sugar，the inoculation amount and the fermentation temperature were chosed as three factors，the center combination of BoxBehnken design experiments was used to study the change of SOD enzyme activity in the fermentation as response value.The experiment data were analyzed by the SAS statistical software to set up quadratic response surface regression model for obtaining the optimal level of the important factor， determining the optimum conditions of fermentation. [Result]The response surface method results showed the optimum condition of producing SOD enzyme activity by cactus fermentation was as follow： the additive amount of sugar 55.0%，the inoculation amount 4.0% and the fermentation temperature 34.0 ℃，in the optima conditions，the SOD enzyme activity was 323.21 U/g. [Conclusion]The study can provide scientific basis for the production of cactus enzyme.

Key words Cactus；Enzyme；Fermentation；Response surface methodology

仙人掌（Opuntia spp.）為仙人掌科（Cactaceae）仙人掌屬（Opuntia）雙子葉植物，含有豐富的微量元素、蛋白質、維生素、多糖類、黃酮類、果膠及18種氨基酸[1-2]。仙人掌具有降血糖、降血脂、降血壓及預防心腦血管疾病等功效[3-4]。酵素（enzyme）又稱作酶，是生物體產生的一種具有催化作用的大分子物質[5]。它是以一種或多種果蔬等為原料，經多種有益菌發酵制備而成的，富含多種生物酶、礦物質、維生素、有機酸、多酚類等功能性生物發酵產品[6]，具有抗氧化、抗菌消炎、潤腸通便、增強機體免疫力、改善消化吸收等保健功能[7-8]。筆者以仙人掌為原料，利用酵母菌和乳桿菌發酵制備仙人掌酵素，探索制備的工藝條件，為仙人掌的綜合利用及工業生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與主要試劑。仙人掌，市售米邦塔仙人掌；酵母菌，安琪酵母股份有限公司；乳酸菌，江西省食品發酵研究所微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要儀器。P270普通搖床，中國科學院武漢科學儀器廠；移液槍，上海榮泰生物工程有限公司；Sw-CJ-1Bu型單人凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；臺式電熱恒溫培養箱，湖北省黃石市醫療器械廠；全自動滅菌鍋，上海三申醫療器材廠；3K18冷凍離心機，美國Sigma公司；恒溫水浴鍋，江蘇金壇市瑞華儀器有限公司；pH計（S23C）型酸度計，上海雷磁儀器廠；分光光度計，上海精密科學儀器有限公司。

1.2 工藝流程

仙人掌→清洗→臭氧處理→淋干→切塊→糖和原料按比例混合→裝罐→添加復合菌種→密封恒溫發酵90 d→后熟處理→過濾→仙人掌酵素原液。

1.3 操作要點

1.3.1 預處理。清洗仙人掌的表面固型雜質，去除仙人掌上的毛刺，用臭氧發生器處理后瀝干，將仙人掌切成4 cm3的小塊備用。

1.3.2 酵母菌的活化和培養。將酵母菌菌粉用蒸餾水混勻，30 ℃水浴活化1 h后，無菌條件下取適量菌液均勻涂布于YPD固體培養基上，30 ℃恒溫培養48 h。繼續重復上述步驟，繼代培養2次后，菌種才可用于發酵使用。

1.3.3 乳桿菌的活化和培養。將乳桿菌菌粉用蒸餾水混勻，37 ℃水浴活化1 h后，無菌條件下取適量菌液均勻涂布于MRS固體培養基上，37 ℃恒溫培養24 h。繼續重復上述步驟，繼代培養2次后，菌種才可用于發酵使用。

1.3.4 接種和發酵。將處理好的仙人掌塊按照一層紅糖一層仙人掌塊的方式逐層放入到發酵罐中，糖的添加量為50%，調節初始pH為6.5，將酵母菌和乳桿菌以2∶3的體積比進行混合后制備成混合菌種（酵母菌活菌數為1×106 CFU/mL，乳桿菌活菌數為1×107 CFU/mL），并按照4%的接種量加入到發酵罐中，在34 ℃恒溫密閉發酵90 d，當發酵液不再產生氣泡時，發酵結束。

1.3.5 后熟與過濾。發酵罐在5 ℃條件下恒溫密閉保藏30 d，使發酵液中各成分充分反應。后熟后將發酵液在150 r/min離心10 min的條件下過濾分離，所得液體為仙人掌酵素原液。

1.4 試驗設計

1.4.1 單因素試驗。分別以糖的添加量、菌種比例、接種量、發酵溫度、發酵時間為響應因素，研究不同水平下各因素對仙人掌酵素超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響。

1.4.2 Box-Behnken 試驗設計。在單因素試驗的基礎上，利用 Box-Behnken 試驗設計原理，采用3因素3水平的響應面分析法，以糖的添加量、接種量、發酵溫度為自變量，以SOD活力為響應值繪制響應面曲線，確定最佳試驗條件。Box-Behnken 試驗因素與水平設計見表1。

1.5 分析方法

SOD活力測定：采用鄰苯三酚自氧化法對試驗中SOD的活性進行測定[9-10]。SOD酶活定義：在1 mL反應液中，1 min抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%時的酶量定為1個活力單位（U）。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 糖的添加量對SOD活性的影響。

由圖1可知，SOD活力隨著糖添加量的增加而升高，當糖的添加量超過50%時，酶活力開始下降。同時，可以看出糖的添加量在40%～60%范圍內對酶活力的影響顯著，因此選擇此范圍內的接種量作為Box-Behnken響應面試驗的影響因子。

2.1.2 菌種比例對SOD活性的影響。

由圖2可知，在酵母菌逐漸增加、乳桿菌逐漸減少的配比下，酶活力隨酵母菌比例的升高而增大，當酵母菌和乳桿菌的比例為2∶3時，SOD活力達到最大，酵母菌比例繼續增加時，酶活力反而有緩慢下降的趨勢。從菌種比例對SOD活力的影響來看，當酵母菌的菌種增加到2∶3之后時，其酶活力變化不大，所以不選擇此因子進行Box-Behnken響應面試驗，同時確定最佳的菌種比例（酶母菌∶乳桿菌）為2∶3。

2.1.3 接種量對SOD活性的影響。

由圖3可知，發酵液中SOD活力隨著菌種接種量的增加而增加，當接種量為4%時SOD活力達到最高值，隨后出現下降趨勢。可能是因為接種量過大，發酵產物顯著減少，因此，選定接種量在3%～5%的范圍進行下一步Box-Behnken響應面試驗。

2.1.4 發酵溫度對SOD活性的影響。

由圖4可知，SOD活力隨著培養溫度的升高而增大，當培養溫度超過34 ℃時，酶活力開始下降。同時，可以看出培養溫度在32～36 ℃范圍內對酶活力的影響較顯著，因此選擇此范圍的發酵溫度作為Box-Behnken響應面試驗的影響因子。

2.1.5 發酵時間對SOD活性的影響。

由圖5可知，SOD活力隨發酵時間的延長先增加后降低。在發酵初期SOD活性較小，發酵60 d后酶活開始逐漸上升；當發酵時間為90 d時，酶活力達到最大值。然而，當發酵時間超過90 d后，酶活力卻有下降趨勢。原因可能是發酵后期菌體處于衰亡期導致營養物質被大量消耗，但又未及時補充，抑制了SOD的不斷積累。所以，選擇發酵時間為90 d。

2.2 響應面試驗結果

按照“1.4.2”方法進行試驗，結果見表2。采用Design Expert 7.0軟件，對表2中的試驗數據進行處理，得到回歸方程，方差分析結果如下：

由方差分析可知，該試驗所建立的二次多項模型具有高度的顯著性（P模型<0.000 1），失擬項不顯著（P>0.05），校正決定系數R2Adj為0.966 0，表明有約96.60% 的SOD活力由此模型進行解釋；方程的決定系數R2為0.985 1，表明仙人掌酵素發酵中SOD活力變化建立的方程對試驗的擬合優度較好。各自變量試驗因素對響應值的影響如下：因素 A（糖的添加量）和C（發酵溫度）對SOD活力的影響均極顯著（P<0.01），因素B（接種量）對SOD活力的影響顯著（P<0.05）。

二次項因素A2、B2和C2均極顯著（P<0.01），具有顯著的曲線關系。BC（接種量與發酵溫度）對SOD活力有極顯著（P<0.01）的交互影響。模型的F值可以反映各因素對試驗響應值的重要性，F值越大，表明對試驗響應值的影響越大，重要性越大[11]。 可見，各因素對SOD活力的影響程度大小順序為糖的添加量>發酵溫度>接種量。

為直觀表現2個因素對SOD活力的影響，可固定一個因素的值，分析另外2個因素對響應值的影響。圖6可反映各因素交互作用對響應值的影響，等高線的形狀可反映出交互效應的強弱大小，橢圓形表示2個因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。可見，糖的添加量和接種量及糖的添加量和發酵溫度的交互作用不顯著，接種量和發酵溫度的交互作用極顯著。同時，3個響應面均為凸型曲面，表明SOD活力存在極高值。根據對SOD活力的二次多項方程求解，得到最佳的仙人掌酵素發酵工藝條件：糖的添加量 55.3%、接種量4.1%、發酵溫度34.42 ℃，在此最佳條件下，SOD活力理論上可達324.14 U/g。

考慮試驗可操作性，修正最佳工藝條件為糖的添加量 55.0%、接種量4.0%、發酵溫度34.0 ℃，在此條件下，連續進行3組平行試驗進行驗證，實際測得SOD活力的平均值為 323.21 U/g，與理論預測值的相對誤差為 0.3%，說明模型擬合性良好，驗證了模型的有效性。該二元多項回歸方程為仙人掌酵素發酵工藝提供了一個合適的模型。

3 結論

筆者在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析法，對仙人掌酵素發酵的工藝條件進行了優化，獲得的最佳配方為糖的添加量 55.0%、接種量4.0%、發酵溫度34.0 ℃，在此最佳條件下，SOD活力可達 323.21 U/g。該仙人掌酵素的發酵工藝在工業化生產中具有一定的指導意義。

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