微生物肥料對草莓根腐病防治效果及對根圍土壤微生物群落多樣性的影響

李麗艷 朱瑞艷 杜迎輝 肖艷

摘要?[目的]探究微生物施肥技術對草莓根腐病的防治效果，為進一步合理應用微生物肥料防治草莓重茬病害提供理論依據。[方法]在草莓生長期施用微生物肥料，于膨果期調查草莓根腐病發病情況，并采集土樣提取土壤基因組DNA，通過PCR擴增建立文庫，利用Miseq 平臺Illumina 第二代高通量測序技術并結合相關生物信息學分析土壤細菌16S rRNA基因V3+V4 區域和真菌ITS1 區域的豐富度和多樣性指數以及群落結構。[結果]微生物肥料可使草莓根腐病發病率降低36.3%，平均防效達63.9%;顯著降低鐮孢菌屬的相對豐度，較對照區降低了97.56%，明顯提高了有益細菌芽孢菌屬的相對豐度，較對照區提高了30.37%。[結論]微生物肥料可有效改善土壤微生物區系并提高作物產量、改善草莓品質。

關鍵詞?草莓根腐病;微生物肥料;微生物群落多樣性

中圖分類號?S144文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2018）33-0111-03

近年來，由于草莓市場需求逐年擴大，種植草莓的連作重茬地面積逐年增加，從而造成草莓根部病害逐年加重，其中草莓根部重要病害之一是草莓根腐病（strawberry root rot）。草莓根腐病是一種較典型的根部土壤傳播病害，防治困難，特別是種植在連作多年草莓地塊的草莓更容易發生草莓根腐病。輕則造成草莓產量下降，重則造成草莓絕收[1]。隨著我國棚區草莓種植面積的逐年增加，草莓根腐病的發生也呈逐年上升趨勢，已成為制約草莓產業正常發展的主要因素之一[2-3]。

在防治該病方面，農藥等化學藥劑的作用巨大，也顯而易見，但長期頻繁使用化學藥劑也在很大程度上增強了病原菌的抗藥性，從而使得化學藥劑的防治效果越來越差[2]，且長期、大量、頻繁地使用農藥等化學藥劑容易破壞整體生態平衡，引起各種環境污染，危害人類健康[1-2]。探尋一條新的途徑來克服或緩解這些制約草莓生產的影響因素具有重要意義。

為此，筆者以常規施肥為對照，選取有代表性的草莓根腐病發病地塊，研究“富思德”微生物肥料對草莓根腐病的防治效果以及對草莓根圍土壤微生物群落多樣性的影響，旨在為采用微生物肥料調節草莓的連作障礙防控技術提供參考。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

“富思德”熒光假單胞菌劑（領先生物農業股份有限公司）：有效活菌數≥5億/mL;“富思德”生物有機肥（領先生物農業股份有限公司）：有效活菌數≥0.2億/g，有機質≥40.0%。作物為連續種植6年棚的草莓，品種為紅顏99。

1.2?試驗設計

試驗于2015年9月在秦皇島昌黎左豐臺草莓種植區進行。對照區為常規化學肥料，肥料用量（折合成純養分）為N 330 kg/hm2 、P2O5 240 kg/hm2、K2O 560 kg/hm2。采用大區對比試驗，各處理面積為667 m2，不設重復。試驗設2個處理：以常規施肥作為對照區（CMB01）;微生物肥料（CMJ02）為處理區。定植前基施“富思德”生物有機肥2 250 kg/hm2;分別在草莓定植期、緩苗期、開花期、膨果期、第一次摘果期、第二次摘果期沖施“富思德”熒光假單胞菌劑75 L/hm2。草莓對照區及處理區各時期施肥及管理措施均為當地種植人員常規管理模式。

1.3?試驗方法

1.3.1?發病率調查。

在草莓膨果期調查草莓根腐病發病情況，每個處理隨機選取6行，每行10 m。發病率、病情指數和防效分別按照下列公式計算[4-7]。

發病率=死苗棵數/調查區間種植總棵數×100%

病情指數=[（病級株數×代表值）/（總株數×最高病級代表值）]×100

防效=（對照區病情指數-處理區病情指數）/對照區病情指數×100%

草莓根腐病發病程度參考[8-9]的方法分為6 級。0 級為根系未見發病;1 級為根系發病率≤30%，葉片較為正常;2 級為30%<根系發病率≤60%，葉片較為正常;3 級為60%<根系發病率≤80%，葉片已開始變黃;4 級為根系發病率80%以上，葉片已枯萎;5 級為整株死亡，葉片整體干枯。

1.3.2?根際土壤微生物多樣性分析

1.3.2.1?土壤微生物DNA提取。

分別在盛果期取對照區及處理區草莓根際土樣，采集時間為2016年4月，每個處理隨機選取5個取樣點，用螺旋取土鉆采集0～10 cm表層新鮮土壤，除去雜物、根系，研磨并過2 mm篩后混合[10]。針對每種新鮮土壤，分別稱取0.5 g，3個重復。用FastDNA Spin Kit for Soil 試劑盒（ MP Biomedicals）提取土壤微生物基因組總DNA[10]，將提取得到的土壤DNA溶解于50 μL TE 緩沖液，詳細操作步驟參考試劑盒說明書。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，DNA 樣品于-20 ℃冰箱保存待用。

1.3.2.2?試驗流程。

提取土壤樣品總DNA后，根據文獻[11]得到細菌V3+V4（F：5′-ARACTYCTACGGRAGGCWG-3′;R：5′-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3′）和真菌ITS1（F：5′-AACCTGCGGAAGGATCATT-3′;R：5′-GARCCAAGAGATCCRTTG-3′）合成引物，PCR擴增并進行純化、定量和均一化后建立測序文庫，質檢合格的文庫用Illumina HiSeq PE250進行測序[12]，該測序工作由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

1.3.3?產量及品質調查。