那西肽高產菌株選育

李依韋 張璐璐 代玉坤

摘要?[目的]選育那西肽高產菌株。[方法]游動放線菌通過紫外誘變與化學誘變，對誘變菌株進行那西肽發酵，測定不同發酵條件下那西肽含量。[結果]對比發酵那西肽產量高低獲得1株發酵那西肽高產菌株zLL。zLL菌株在豆粉40 g/L、淀粉酶0.4 g/L、淀粉70 g/L、（NH4）2SO4 1.0 g/L、CaCO3 4 g/L，pH 6.5的優化發酵培養基條件下，那西肽產量最高為1 582.73 μg/mL。與未優化發酵培養基相比，提高了16.65%。[結論]該研究為今后那西肽的大規模發酵生產提供了基礎數據。

關鍵詞?那西肽;誘變育種;高產菌株

中圖分類號?R978.1文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2018）33-0080-03

那西肽（nosiheptide）是一類可以從鏈霉菌中產生的包含多個噻唑環的硫多肽類抗生素，屬于具有很強抗菌活性的硫鏈絲菌類抗生素[1]。鏈霉菌通過合成抗生素基因分析并表達自身抗性[2]。那西肽是一類非吸收型環保飼料添加劑，具有促進畜禽生長、促進營養吸收、增重增產、沒有交叉耐藥性、提高飼料利用率，且在動物體內低毒無殘留，對環境污染小等優點[3]。那西肽具有促進肝細胞生長、抑制乙肝病毒分泌、抗病毒和抗感染特征[4]。那西肽具有臨床藥物開發前景，但是由于那西肽水溶性差，因此目前不能應用于臨床研究[5]。

雖然那西肽具有良好的市場經濟效益，但是由于菌種性能限制，產量目前不能滿足于大規模的工業生產。高產菌株選育一直都是抗生素生產工作重點，誘變育種是高產菌株選育常用方法之一。通常對鏈霉菌采用NTG、紫外線及NTG-紫外線的聯合進行誘變育種獲得高產菌株[6]。筆者對分離獲得的游動放線菌孢子進行紫外誘變與化學誘變，篩選得到高產菌株，為那西肽生產提供基礎資料。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?菌種。游動放線菌（內蒙古民族大學生命科學學院微生物生物技術實驗室保存）。

1.1.2?培養基。

1.1.2.1?基本培養液。NaCl 0.5 g/L、KNO3 1 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、FeSO4 0.01 g/L、可溶性淀粉20 g/L、MgSO4 0.244 g/L，pH 7.3，121 ℃高溫滅菌20 min。

1.1.2.2?種子培養基。葡萄糖 30 g/L、玉米漿 20 g/L、黃豆粉 20 g/L、CaCO3 5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、（NH4）2SO4 3.0 g/L，pH 6.5，115 ℃高溫滅菌25 min。

1.1.2.3?發酵培養基。黃豆粉 35 g/L、淀粉 70 g/L、淀粉酶0.3 g/L、豆油 0.4 mL/L、（NH4）2SO4 1.5 g/L、CaCO3 5 g/L，pH 6.5，115 ℃高溫滅菌25 min。

1.1.2.4?優化發酵培養基。黃豆粉40 g/L、淀粉70 g/L、淀粉酶0.4 g/L、豆油0.3 mL/L、（NH4）2SO4 1.0 g/L、CaCO3 4 g/L，pH 6.5，115 ℃高溫滅菌25 min。

1.2?方法

1.2.1?制備孢子懸液。低溫保存的放線菌活化后，取生長好的孢子，3 500 r/min，離心15 min，用pH 7.2的磷酸緩沖液洗滌并分散孢子。孢子液用4層無菌擦鏡紙過濾，鏡檢，獲得單孢子懸液。

1.2.2?繪制那西肽標準曲線。準確稱量那西肽標準品5 mg，0.1 mL DMF（N，N二甲基甲酰胺）溶解，加入硼酸緩沖液制成1 mg/mL標準液。取不同體積的標準液用硼酸緩沖液、磷酸緩沖液和正丁醇稀釋，得到不同濃度的那西肽溶液，37 ℃水浴15 min。取1.5 mL上層液體與1.5 mL無水乙醇搖勻，在波長408 nm處測定各濃度的吸光度。以吸光度值為縱坐標，那西肽濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.3?化學誘變。單孢子懸液1 mL，各加入1 mL磷酸緩沖液，300 μL 0.2 μg/mL的EMS（甲基磺酸乙酯）溶液，設置誘變時間為10、20、30、40、50、60 min，誘變結束后，取100 μL 0.02 mg/mL NaS2O3洗滌后離心，重復洗滌1次，用于菌種篩選，以原始孢子為對照。

1.2.4?紫外誘變。單孢子懸液1 mL，進行紫外誘變，設置誘變時間為1、2、3、4 min，誘變后用于菌種篩選，以原始孢子為對照。

1.2.5?菌種篩選。將誘變后的孢子液移入基本培養液，28 ℃、200 r/min，振蕩培養10 h，無菌擦鏡紙過濾，除去菌絲獲得孢子液，鏡檢。取誘變后孢子液稀釋至10-3，涂布于高氏1號培養基，28 ℃培養7 d，觀察菌落。

挑取單菌落接種于種子培養基，28 ℃、270 r/min，振蕩培養48 h，以接種量5%移入發酵培養基，振蕩培養40 h，在波長408 nm處測發酵液中那西肽含量。

1.2.6?那西肽產量的影響因素篩選。對影響發酵培養基的以下因素進行篩選，即酸堿度、豆粉、淀粉、CaCO3、（NH4）2SO4、淀粉酶，調整各因素含量進行發酵并測定那西肽含量，篩選出最佳成分含量[7-8]。

1.2.7?最佳發酵培養基確定。挑取zLL菌落接種于種子培養基，28 ℃、270 r/min振蕩培養48 h，以接種量5%移入“1.2.6”篩選的優化發酵培養基中培養40 h，測發酵液中那西肽含量。

2?結果與分析

2.1?那西肽標準曲線

由圖1中方程y=1.806 7x+0.030 0（R2=0.998 6）可知，那西肽濃度與吸光值呈良好的線性關系，可作為那西肽含量測定標準。

2.2?化學誘變

由圖2可知，誘變40 min時那西肽含量最高，達903.73 μg/mL，與對照相比（那西肽含量為882.81 μg/mL）提高了2.37%。

2.3?紫外誘變

由圖3可知，誘變2 min時那西肽含量最高，達1 356.82 μg/mL，與對照相比（那西肽含量為882.81 μg/mL）提高了53.69%，獲得1株高產那西肽菌株zLL。

2.4?發酵的影響因素

由圖4～9可知，設置不同酸堿度時，那西肽含量不同，在pH 6.5時，那西肽產量最高，為1 486.53 μg/mL;豆粉含量為40 g/L時，那西肽產量最高，為1 484.59 μg/mL;淀粉含量為70 g/L時，那西肽產量最高，為1 471.83 μg/mL;CaCO3含量為4 g/L時，那西肽產量最高，為1 461.83 μg/mL;（NH4）2SO4含量為1.0 g/L時，那西肽產量最高，為1 414.87 μg/mL;淀粉酶含量為0.4 g/L時，那西肽產量最高，為1 417.36 μg/mL。

2.5?最佳發酵培養基確定

在豆粉40 g/L、淀粉酶0.4 g/L、淀粉70 g/L、（NH4）2SO4 1.0 g/L、CaCO3 4 g/L，pH 6.5的條件下，發酵液中那西肽含量1 582.73 μg/mL，與對照那西肽含量（1 356.82 μg/mL）相比提高了16.65%。

3?結論

對保存的游動放線菌進行化學誘變與物理誘變，對誘變菌株發酵那西肽產量進行對比，結果篩選出1株高產菌株，在紫外誘變2 min時那西肽含量達1 356.82 μg/mL，與出發菌株相比（那西肽含量為882.81 μg/mL）提高了53.69%;對發酵培養基進行優化，在豆粉40 g/L、淀粉70 g/L、淀粉酶0.4 g/L、（NH4）2SO4 1.0 g/L、CaCO3 4 g/L，pH 6.5的條件下，那西肽產量為1 582.73 μg/mL，與未優化發酵培養基（那西肽含量為1 356.82 μg/mL）相比提高了16.65%。

參考文獻

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[2] 李德才.活躍鏈霉菌產那西肽發酵過程優化控制[D].蕪湖：安徽工程大學，2015.

[3] 張秀英，陸連壽，溫芳，等.國家那西肽標準品的研制與建立[J].中國獸藥雜志，2014，48（12）：50-53.

[4] 張小朋，曹春華，朱游子，等.那西肽的發展狀況及其發酵工藝研究進展[J].飼料工業，2014，35（22）：59-62.

[5] 于麗娜，韓寧寧，徐嫄，等.那西肽預混劑質量分析[J].中國抗生素雜志，2016，41（10）：767-770.

[6] 高自召.鏈霉素抗性突變選育那西肽高產菌株[J].中國獸藥雜志，2012，46（8）：43-46.

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[8] 周揚，薛正蓮，秦艷飛，等.24孔板培養活躍鏈霉菌合成那西肽條件的優化[J].中國抗生素雜志，2015，40（5）：344-349.