高效液相色譜法測定茶鮮葉中18種游離氨基酸含量初探

董尚文 劉騰飛 董明輝

摘 要 建立了一種快速、靈敏、準確的柱前衍生-高效液相色譜-熒光檢測器測定茶鮮葉中18種游離氨基酸含量的方法。將茶鮮葉樣品攪碎混勻，以超純水作為萃取溶劑，在90 ℃水浴下浸提20 min，以6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯為衍生劑柱前衍生化，使用Symmetry C18色譜柱梯度洗脫。以3倍信噪比計算方法的檢出限，18種氨基酸的檢出限為0.05～1.27 μmol·L-1。應用該方法檢測了2個碧螺春茶鮮葉中18種氨基酸含量。結果表明，該方法簡便、準確、快速、可靠。

關鍵詞 茶鮮葉；游離氨基酸；柱前衍生化；高效液相色譜

中圖分類號：TS272 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.11.071

茶是世界三大天然飲料之一，具有獨特的香氣、豐富的營養和保健功效[1-2]，深受消費者喜愛。茶葉中氨基酸的分析方法有很多，中國發明專利“利用反相高效液相色譜檢測茶葉中游離氨基酸的方法”（專利號ZL201510109474.4）以6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯為柱前衍生劑，使用氨基酸專用分析柱進行梯度洗脫，結合反相高效液相色譜，實現了對茶葉中谷氨酰胺等19種氨基酸的定量分析。

本研究以茶葉鮮樣代替茶葉干樣作為樣品，選用普通的Symmetry C18柱代替氨基酸分離專用柱，采用6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯為柱前衍生劑[3]，利用高效液相色譜-熒光檢測器分離分析，實現了同時測定茶葉鮮樣中18種游離氨基酸的目的，為開展茶葉質量評價、等級評定、指紋圖譜構建提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 儀器與設備

2695高效液相色譜儀，配2475熒光檢測器；TG16-WS臺式高速離心機；K600粉碎機；LE-3000電熱恒溫水浴鍋；Direct-Q 5 UV超純水機。

1.1.2 藥品與試劑

氨基酸標準品：天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、組氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸、胱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和17種氨基酸混合標準品，衍生試劑為6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯；乙腈為色譜純；實驗用水為超純水。

1.1.3 供試樣品

茶葉鮮樣取自蘇州洞庭東山和西山碧螺春茶園。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

1）氨基酸標準溶液。精密稱取各氨基酸標準品適量，置于25 mL容量瓶中，加超純水溶解并定容至刻度，得氨基酸單一標準溶液，其中茶氨酸濃度為12.5 μmol·L-1，于-20 ℃冰箱保存。

取17種氨基酸混合標液40 μL，加入40 μL 12.5 μmol·L-1茶氨酸標準溶液，用超純水定容到1 mL，得到含茶氨酸的氨基酸混合標液，其中茶氨酸濃度為

500 μmol·L-1、胱氨酸為50 μmol·L-1，其余各氨基酸濃度均為100 μmol·L-1。

2）磷酸鹽緩沖液。稱取19.0 g三水醋酸鈉，1.72 g三乙胺溶于1 000 mL水，用磷酸調節pH至5.05，加適量EDTA，用0.45 μm濾膜過濾。

3）AQC衍生液。向AQC粉末瓶中加入1.25 mL乙腈，渦旋混合，在55 ℃條件下加熱至溶解。

4）硼酸鹽緩沖液。稱取12.36 g硼酸，加400 mL水溶解，用400 g·L-1氫氧化鈉溶液調pH至8.8，然后加水稀釋至500 mL，得到0.4 mol·L-1硼酸鹽緩沖液。

1.2.2 樣品制備

取茶葉鮮樣攪碎并混合均勻，稱取0.25 g，加入10 mL沸水，在90 ℃的水浴鍋中浸提20 min，冷卻至室溫后，3 000 r·min-1離心5 min，上清液加水定容10 mL，過0.45μm微孔濾膜后備用。

1.2.3 衍生化反應

準確移取10 μL標準品溶液或茶鮮葉樣品溶液，置于自動進樣瓶中，加入70 μL硼酸鹽緩沖液，渦旋混合。取20 μL AQC衍生液，在渦旋狀態下加入進樣瓶中，渦旋混合10～20 s，靜置1 min后在55 ℃下加熱10 min，取出冷卻至室溫，供分析用。

1.2.4 儀器分離條件

色譜柱：Symmetry C18柱。柱溫37 ℃，流速2.0 mL·min-1。熒光檢測：激發波長250 nm、發射波長395 nm；進樣量10 μL。流動相：A為磷酸鹽緩沖液，按l∶10用超純水稀釋；B為100%乙腈；C為100%超純水。梯度洗脫程序：0 min，100%A；0.5 min，98%A+2.0%B；0.5～9.0 min，96.5%A+3.5%B；9.0～

9.5 min，95.0%A+5.0%B；9.5～11.5 min，91.5%A+8.5%B；11.5～13.0 min，83.0%A+17.0%B（保持4 min）；17.0 min，60.0%B+40%C（保持2 min）；19～23 min，100%A。

1.2.5 定量測定

根據氨基酸標準品的保留時間對樣品中的氨基酸定性，使用外標曲線計算樣品中各氨基酸的含量。

2 結果與分析

2.1 氨基酸標準溶液的色譜分離

18種氨基酸混合標液HPLC圖譜如圖1所示。從圖1可以看出，氨基酸各組分之間的分離度良好，出峰緊湊且峰形對稱，分析周期為23 min，在保證了分離效果的同時，實現了快速分析的目的和效果。

2.2 方法的回歸方程、相關系數及檢出限

配制濃度分別為5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、250 μmol·L-1的氨基酸混標溶液，衍生化后進樣測定，結果表明，在5～250 μmol·L-1范圍內，氨基酸的濃度與其峰面積的線性關系良好，相關系數為0.997 8～0.999 9。

2.3 方法回收率

精密稱取0.25 g已知氨基酸含量的茶鮮葉樣品5份，向其中加入一定體積的氨基酸混合標液，進行樣品制備、衍生反應后測定，采用外標法定量，計算各氨基酸的回收率和RSD。

18種氨基酸的回收率在86.25%～109.05%，RSD在6.03%～10.56%，說明本方法準確度高，重現性好，方法可靠。

2.4 方法精密度

取適量含18種氨基酸的混合標液，按上述方法衍生后進樣分析，連續進樣5次，以色譜峰的保留時間和峰面積為指標計算RSD，考察其精密度。各氨基酸保留時間RSD在0.09%～0.55%，峰面積RSD在1.12%～2.15%，說明本方法精密度較高。

2.5 方法重復性

取同一茶鮮葉樣品5份，按上述方法提取、衍生、測定，以色譜峰面積超過1%的氨基酸的保留時間和峰面積為指標分別計算RSD，考察方法的重復性。茶鮮葉所含氨基酸峰保留時間RSD在0.55%～1.98%，峰面積RSD在2.08%～3.71%，重復性較好。

2.6 方法穩定性

取同一茶鮮葉樣品供試溶液，按照上述方法衍生，分別在0 h、4 h、8 h、12 h和24 h進樣，以色譜峰峰面積超過1.0%的氨基酸的保留時間和峰面積為指標計算RSD，考察茶鮮葉中氨基酸衍生化溶液的穩定性。各氨基酸衍生化產物保留時間RSD在0.23%～2.01%（n=5），峰面積RSD在1.18%～3.91%（n=5）。表明氨基酸衍生化溶液在室溫下可以穩定24 h。

3 方法應用

應用建立的方法，分別對蘇州洞庭東山和洞庭西山的2個碧螺春茶葉鮮樣中的游離氨基酸進行測定.

4 結論

建立了一種快速、靈敏、準確的柱前衍生-高效液相色譜-熒光檢測器測定茶鮮葉中18種游離氨基酸含量的方法。將茶鮮葉樣品攪碎混勻，以超純水作為萃取溶劑，在90 ℃水浴下浸提20 min，以6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯為衍生劑柱前衍生化，使用Symmetry C18色譜柱梯度洗脫。同時，Symmetry C18柱價格便宜，專屬性不強，可以用于其他物質的檢測，大大節約分析的成本，特別適合在廣大基層檢測機構和單位推廣使用。

參考文獻：

[1] 張慶，陳祥貴，李曉霞，等.茶的保健作用研究進展[J].中國食物與營養，2005（9）：38-41.

[2] 肖玫，楊麗琴，劉曉明，等.茶葉的營養與保健價值及其開發利用[J].中國食物與營養，2005（12）：23-24.

[3] 李梅，劉金華，樓兵干，等.植物鮮樣中游離氨基酸提取方法的比較[J].實驗室研究與探索，2016，35（4）：34-38.

（責任編輯：趙中正）