HPLC法測(cè)定山葡萄藤中白藜蘆醇含量

楊榮艷 劉琬暉 高楠楠

[摘要] 目的 建立采用超聲提取，高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定山葡萄藤中白藜蘆醇的含量。方法 采用色譜柱：Inertsil ODS-3 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.05%磷酸溶液（40：60）；流速：1.0 mg/mL；柱溫：30℃；檢測(cè)波長：306 nm； 進(jìn)樣量：10 μL。結(jié)果 白藜蘆醇在0.504～75.6 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。測(cè)定10批山葡萄藤中白藜蘆醇平均含量為0.48%，平均回收率95.16% （RSD=1.94%，n=9）。結(jié)論 該實(shí)驗(yàn)采用超聲提取，并對(duì)提取條件進(jìn)行探討，得出最佳條件為超聲時(shí)間45 min、超聲功率300 W、固液比1∶250（g/mL）、溶劑為甲醇。該研究表明該方法簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、可靠，專屬性強(qiáng)，可用于山葡萄藤的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 山葡萄藤；高效液相色譜法；白藜蘆醇

[中圖分類號(hào)] R284.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1672-5654（2018）05（c）-0006-03

[Abstract] Objective Ultrasonic extraction and high performance liquid chromatography （HPLC） were used to determine the content of resveratrol in grape vines. Methods Chromatography column： inertsil ODS-3 C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm）； mobile phase： methanol-0.05% phosphoric acid solution （40：60）； flow rate： 1.0 mL/min； column temperature ： 30°C； detection wavelength： 306 nm； injection volume： 10 μL. Results Resveratrol showed a good linear relationship in the range of 0.504 to 75.6 mg/mL. The average content of resveratrol in 10 batches of vines was 0.48%， and the average recovery was 95.16%（RSD=1.94%，n=9）. Conclusion Ultrasonic extraction was used in this experiment and the extraction conditions were investigated. The optimal conditions were： ultrasonic time 45 min， ultrasonic power 300 W， solid-liquid ratio 1：250（g/mL）， and methanol as the solvent. The study shows that this method is simple， rapid， economical， reliable， and highly specific. It can be used for quality control of vine vines.

[Key words] Mountain vines； High performance liquid chromatography； Resveratrol

山葡萄藤是吉林省食品藥品監(jiān)督管理局下達(dá)制定的地方藥材標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)劃文件號(hào)為2016009。山葡萄藤為葡萄科植物山葡萄 Vitis L. amurensis Rupr.干燥藤莖。春至秋季采藤莖，曬干。其主產(chǎn)于東北、山西、山東等地[1-2]，山葡萄藤為“消風(fēng)止痛寧膠囊”中的君藥，其味酸、涼，歸腎、肝、膀胱經(jīng)[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，山葡萄藤主要含有白藜蘆醇成分[3]，白藜蘆醇是在逆境或遭遇到病原侵害時(shí)分泌的一種植保素，具有抗衰老、皮膚保健和抗腫瘤作用[4]。目前白藜蘆醇成分在虎杖、山葡萄、山葡萄葉和葡萄籽中研究報(bào)道比較多[5-9]，尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)山葡萄藤中白藜蘆醇成分進(jìn)行了定量研究。該實(shí)驗(yàn)利用HPLC法測(cè)定山葡萄藤中白藜蘆醇含量，此方法簡單環(huán)保、準(zhǔn)確且重復(fù)性好，為山葡萄質(zhì)量控制和評(píng)估提供新的參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1260高效液相色譜儀（帶DAD檢測(cè)器）；島津LC-2010AHT高效液相色譜儀（帶紫外檢測(cè)器）；電子天平BT125D型（北京賽多利斯儀器有限公司）；超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率300 W，頻率40 kHz）；純水器（德國）。

1.2 試藥

山葡萄藤藥材10 批，均采自吉林省，并經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院韓忠明教授鑒定（見表1）；白藜蘆醇對(duì)照品（批號(hào)111535-200301，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇為色譜純（天津康科德科技有限公司），磷酸為分析純（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所）、水為實(shí)驗(yàn)室自制的超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Inertsil ODS-3 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.05%磷酸溶液（40：60）； 流速： 1.0 mL/min； 柱溫：30℃；檢測(cè)波長： 306 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取白藜蘆醇對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取該品粉末（過三號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。實(shí)驗(yàn)過程要避光操作。

2.4 專屬性考察

取對(duì)照品溶液和供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1、圖2。白藜蘆醇的保留時(shí)間為22.008 min，且與鄰近的色譜峰分離度均大于1.5。

2.5 線性關(guān)系考察

取白藜蘆醇對(duì)照品20.16 mg，置200 mL量瓶中用甲醇溶解并定容至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液（100.8 μg/mL）。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1、5、10、20、50、75 mL分別置100 mL容量瓶中用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得（此溶液濃度分別為0.504、1.008、5.04、10.08、20.16、50.4、75.6 μg/mL）。分別精密吸取10 μL進(jìn)樣，在上述色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X ），峰面積為縱坐標(biāo)（Y ），得回歸方程Y=78.13X-5.984（r2=0.999 9）。結(jié)果表明在此分析條件下，白藜蘆醇在0.504～75.6 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取S1 樣品，按照供試品溶液制備方法，制備供試品溶液，分別放置0、2.5、5、8、10、16、18、31 h時(shí)，按照上述色譜條件，測(cè)定白藜蘆醇峰面積。結(jié)果按峰面積計(jì)算，RSD=0.4%。結(jié)果表明樣品溶液在31 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 精密度試驗(yàn)

將白藜蘆醇對(duì)照品溶液（20.16 μg/mL）按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果峰面積RSD為0.3%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取S1 樣品，按供試品溶液制備方法平行制備6 份供試品溶液，按照上述色譜條件實(shí)驗(yàn)，山葡萄藤藥材中白藜蘆醇的含量平均值為0.48%，RSD=1.59%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已測(cè)定S1 樣品9 份各0.2 g，每3 個(gè)為一組，每組按照低、中、高分別加入對(duì)應(yīng)含量的對(duì)照品溶液，再按照供試品溶液制備過程制備供試品，得到3 組9 個(gè)樣品溶液，按照之前色譜條件進(jìn)樣測(cè)定分析，平均回收率為 95.16%，RSD=1.94%（n=9）。

2.10 含量測(cè)定

取10 批山葡萄藤藥材0.2 g，精密稱定，按供試品溶液制備過程制備供試品溶液，在再按照之前色譜條件對(duì)10 批山葡萄藤藥材進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 測(cè)定波長的選擇

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，白藜蘆醇在306 nm波長處有最大吸收[10]。以甲醇-0.05%磷酸溶液（40：60）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，將對(duì)照品溶液、供試品溶液分別注入帶有DAD檢測(cè)器的液相色譜儀，結(jié)果白藜蘆醇對(duì)照品在306 nm附近有最大吸收。山葡萄藤樣品中在306 nm處也有最大吸收峰，并且紫外光譜與對(duì)照品紫外光譜相同。因此，該實(shí)驗(yàn)采用306 nm作為測(cè)定波長。

3.2 提取方法的考察

取S1樣品2份，每份（過三號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入甲醇25 mL，稱定重量，分別考察：①超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）45 min，②加熱回流45 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。結(jié)果表明超聲處理、加熱回流后，樣品含量幾乎沒有差異，從操作簡便、節(jié)能角度考慮，選擇超聲處理作為提取方法。

3.3 提取溶劑的考察

取S1樣品4份，每份（過三號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入甲醇、50%甲醇、60%乙醇、70%乙醇各25 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）45 min放冷，再稱定重量，用各自的溶劑補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。結(jié)果用甲醇做提取溶劑時(shí)，樣品含量比其他3種提取溶劑高，所以選擇用甲醇做提取溶劑。

3.4 超聲時(shí)間的考察

取S1樣品4份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入甲醇25 mL，超聲處理15、30、45、60 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。結(jié)果表明超聲處理45、60 min時(shí)樣品含量較高，二者相差較小，正文選取了超聲處理為45 min。

3.5 稀釋體積的考察

取S1樣品6份，每份（過三號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，前3份樣品分別精密加入甲醇25、50、100 mL，后3份樣品做100%加標(biāo)回收，結(jié)果表明稀釋體積為精密加入甲醇50、100 mL時(shí)，樣品含量回收率分別為96.21%、96.23%，二者的回收率相差不大，故正文選取了精密加入甲醇50 mL。

3.6 超聲功率的考察

取S1樣品3份，每份（過三號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入甲醇50 mL，在180、240、300 W 3種功率下超聲處理45 min，結(jié)果表明超聲功率為300 W時(shí)樣品含量較高，正文選取了超聲處理的功率為300 W。

3.7 色譜柱的考察

分別考察了3根不同廠家的色譜柱（Inertsil ODS-3 C18色譜柱、Inertsil ODS-SP C18色譜柱、WondaSil C18-WR色譜柱），結(jié)果表明：3個(gè)不同品牌的色譜柱，分離效果都很好。

3.8 光照對(duì)白藜蘆醇的考察

把同一濃度的白藜蘆醇對(duì)照品溶液分別在避光條件下、光照3 h后注入液相色譜儀測(cè)定，檢驗(yàn)結(jié)果：光照3 h后，白藜蘆醇對(duì)照品溶液分解為兩個(gè)峰，白藜蘆醇峰面積為避光條件下峰面積的1/6。故正文要求避光操作。

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（收稿日期：2018-02-23）