玉米根際球孢白僵菌群體遺傳多樣性的ISSR分析

齊永霞　陳方新

摘要

為了明確玉米根際球孢白僵菌的遺傳分化情況及親緣關系，通過ISSRPCR分子標記技術對分離自玉米根際的球孢白僵菌的遺傳多樣性進行了研究。從40個引物中共篩選出11個多態性高、穩定性好的引物用于正式的擴增分析，在37個菌株中共擴增出83條譜帶，其中多態性條帶占69條，多態性百分率為83.13%。平均每引物擴增條帶在7.5條。群體的多態位點百分率（PPL）為83.13%，Nei基因多樣性指數（H）為0.316 9，Shannon信息指數（I）為0.465 7。結果表明，分離自安徽省渦陽、蕭縣、蒙城三個地區的球孢白僵菌具有較高的遺傳多樣性。研究結果對進一步探討玉米根際球孢白僵菌不同菌株的生防效果具有重要意義。

關鍵詞

球孢白僵菌； 分子標記； 遺傳分化； 遺傳多樣性

中圖分類號：

S 476.12

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017184

Genetic diversity of Beauveria bassiana in maize rhizosphere by

intersimple sequence repeat （ISSR） markers

QI Yongxia， CHEN Fangxin

（College of Plant Protection， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China）

Abstract

To identify the genetic differentiation and genetic relationships among the isolates of Beauveria bassiana from maize rhizosphere， the genetic diversity of 37 B.bassiana strains was estimated by using intersimple sequence repeats （ISSR） markers. Eleven of 40 ISSR primers were chosen for analysis of their reproducibility and high polymorphism. Each primer resulted in 7.5 markers and totally 83 fragments were amplified， in which 69 （83.13%） were polymorphic. Genetic diversity analysis revealed a relatively high level of intraspecific genetic diversity of B.bassiana. The percentage of polymorphic loci （PPL） was 83.13%； Neis genetic diversity （H） was 0.316 9 and Shannons information index （I） was 0.465 7. It suggested that the 37 B.bassiana strains isolated from Guoyang， Xiaoxian and Mengcheng had high genetic diversity. The results were of great significance for further studying the biological control effect of B.bassiana strains.

Key words

Beauveria bassiana； molecular marker； genetic differentiation； genetic diversity

白僵菌Beauveria sp.是重要的生物防治資源，據報道，白僵菌可用于防治農、林、衛生等多種害蟲，均取得良好的效果[13]。球孢白僵菌B.bassiana是白僵菌屬中最著名的種，其在自然界的寄主范圍廣泛，可侵染15目149科700多種昆蟲，是極有利用價值的蟲生真菌[47]。隨著分子生物學技術的飛速發展和新技術的不斷涌現，人們已經開始利用分子生物學的研究技術對蟲生真菌的遺傳多樣性進行研究，從而彌補了形態和培養性狀高度變異給傳統分類方法帶來的困擾，給種下菌株的親緣關系鑒定提供了可靠的依據，有助于加強對蟲生真菌遺傳多樣性的研究，并為釋放菌株的檢測和追蹤提供可靠的依據。

迄今為止，已有多種DNA分子標記技術用于白僵菌的群體遺傳多樣性研究。丁德貴等[8]利用酯酶同工酶研究了球孢白僵菌種群在松林中的寄主轉移及遺傳多樣性對松毛蟲持續控制的影響，分析結果表明松林中球孢白僵菌呈現出豐富的遺傳多樣性。方志剛等[9]、林華峰等[10]采用RAPD技術分析了球孢白僵菌菌株的遺傳分化，發現菌株間具有較豐富的遺傳多態性，且菌株DNA多態性與采集地之間有一定的相關性。陳名君等[11]利用28S rDNAⅠ型內含子技術研究了瑯琊山球孢白僵菌菌株的遺傳多樣性，結果顯示同一地區的菌株在固定時間內有較豐富的菌株類型，種群的遺傳結構多樣化。ISSR（intersimple sequence repeats，簡稱ISSR）技術是一種新型的分子標記，在真菌的遺傳多樣性研究中廣泛應用[12]。該技術依據SSR廣泛存在于真核基因組中，利用基因組中常出現的SSR本身設計引物，對SSR之間的序列進行擴增，其擴增的引物長度為16～18個堿基，引物通常由1～4個堿基組成的串聯重復和幾個非重復的錨定堿基組成，不需要預先克隆和測序[1315]。與RAPD和AFLP等分子標記相比，由于其引物序列較長，退火溫度高，DNA用量小、安全性較高，可以快速、高效和靈敏地檢測出基因組DNA的多態性，而且操作簡單、成本較低，具有更高的重復性，是一種非常理想的檢測種內遺傳變異的分子標記[1617]。李旻等[18]應用ISSR分子標記技術研究了安徽省大別山區不同海拔高度和不同時間段采集到的球孢白

僵菌的遺傳多樣性，發現安徽省大別山區球孢白僵菌存在較高的遺傳多樣性，其中，種群間遺傳變異相對較小，種群內表現出較高水平的遺傳分化。胡曉磊等[19]用ISSR技術分析了中國南方球孢白僵菌的遺傳多樣性及種群遺傳結構，結果顯示中國南方球孢白僵菌的遺傳多樣性水平較高，且種群異質性較強。

研究表明，球孢白僵菌廣泛分布于不同的生態環境中，其中包括植物根際和組織[2021]。玉米是安徽省重要的糧、飼作物，其在生長過程中經常遭受地下害蟲及土傳病害的危害，為了了解球孢白僵菌在玉米根際的分布情況，作者從安徽省渦陽縣、蕭縣和蒙城縣3個玉米種植區廣泛采集根際土樣，通過稀釋分離法共分離獲得37個球孢白僵菌菌株[22]。本文采用ISSRPCR技術，旨在從分子水平上探明來自不同地區的玉米根際球孢白僵菌群體遺傳結構及親緣關系，探討球孢白僵菌菌株DNA圖譜與菌株的地理來源之間的相關性，為進一步研究37個菌株對玉米地下害蟲及土傳病害的生物防治效果提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的37個球孢白僵菌菌株從安徽省渦陽縣、蕭縣、蒙城縣采集的玉米根際土壤中分離獲得，經形態學方法結合rDNA ITS鑒定為球孢白僵菌，其中渦陽縣22株，編號為GY1～GY4、GY6～GY20、GY22、GY23、GY25；蒙城縣9株，編號為MC2，MC7～MC14；蕭縣6株，編號為XX1、XX3、XX5、XX6、XX12、XX13。

SDAY培養基[23]：酵母浸出粉10 g；蛋白胨10 g；葡萄糖40 g；瓊脂15 g；水1 000 mL。

Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司；dNTPs、DNA marker等購于上海生工生物工程股份有限公司。40個ISSR引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2 球孢白僵菌菌絲體制備

將供試菌株制成孢子懸浮液，取0.2 mL轉接于鋪有玻璃紙的SDAY培養基平板上，倒置于恒溫光照培養箱中25℃培養4～6 d，將長滿全皿而未大量產孢的菌絲體在無菌條件下取出，置于5 mL的滅菌離心管中，經冷凍干燥后于-20℃保存備用。

1.3 球孢白僵菌基因組DNA的提取

采用改良的CTAB法[24]提取球孢白僵菌基因組DNA。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA。用Eppendorf分光光度計測得濃度后將樣品濃度稀釋到50 ng/μL備用。

1.4 球孢白僵菌的ISSR分析

1.4.1 引物的篩選

為了得到有效的ISSR分子標記，對合成的40條ISSR引物進行了前期預篩選試驗。以GY1～GY6、MC2、MC6、XX1和XX3共10個菌株的DNA為模板，在25 μL反應體系中進行引物擴增效果及可重復性檢測。最終從40條引物中選出11條擴增條帶清晰、重復性好及多態性高的ISSR引物用于37個菌株的PCR擴增，引物編號及序列見表1。

1.4.2 ISSRPCR分析

ISSRPCR擴增反應采用25 μL反應體系：超純水（ddH2O）19.5 μL，10×Buffer緩沖液（含Mg2+） 2.5 μL，dNTPs（濃度2.5 mmol/L）1.25 μL，引物（濃度10 μmol/L）0.1 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，50 ng/μL模板DNA 0.5 μL。

ISSRPCR擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，復性溫度復性1 min，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min。

每個引物重復試驗3次，每次反應均設不加模板的空白對照。擴增結果用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 數據分析

將ISSR電泳膠圖進行人工讀帶，每條擴增片段計作1個多態性位點。ISSR是顯性標記，每個樣品的擴增帶按照有或無記錄，有帶記為1，無帶記為0。將DNA凝膠電泳圖譜轉換為數字矩陣。通過NTSYSpc 2.1生物軟件進行UPGMA聚類分析，構建各菌株的親緣關系樹狀圖，利用POPGEN 32軟件對全部種群和各單個種群分別進行遺傳參數分析，分別計算觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Nei（1973）基因多樣性指數（He）、Shannon信息多樣性指數（I）、多態位點百分率（PPL）、群體內基因多樣性（Hs）、群體總基因多樣度（Ht）、群體間的遺傳分化系數（Gst）、Nei（1978）遺傳距離（D）和遺傳一致度（I）等。

2 結果與分析

2.1 球孢白僵菌ISSR擴增產物的多態性

通過預試驗，對40條ISSR引物進行篩選，調整確定不同引物的退火溫度，最終篩選出擴增條帶清晰、結果穩定，多態性好的11條引物對37個球孢白僵菌菌株進行多態性檢測。由表2可以看出，這11個引物均能從供試的37個菌株中擴增出清晰明亮條帶，條帶分布合理。不同引物共擴增出83條譜帶，其中多態性譜帶為69條，多態性百分率為83.13%。引物P59（（AG）8YC）擴增出的條帶最多，條帶數為12條，多態性條帶為10條，多態位點比率為83.33%。引物P6、P11、UBC813和UBC825擴增條帶的多態性位點比例最高，均為100%。引物UBC813（（CT）8A）擴增出的條帶數最少，只有2條。平均每個引物擴增的條帶數為7.5條。結果表明，11個引物都具有一定的標記多態性，ISSR標記能產生各自有效的多態性條帶，但多態性水平各不相同。為了分析地理來源對球孢白僵菌遺傳多樣性的影響，供試菌株選自安徽省渦陽縣、蕭縣和蒙城縣三個不同的地區，ISSR標記結果顯示安徽省玉米根際球孢白僵菌存在豐富的遺傳多樣性，但所測試的11個引物中沒有能反映菌株與地理來源有特異性宗譜的特異引物。引物P59和UBC834的ISSR圖譜見圖1。

2.2 球孢白僵菌遺傳多樣性與群體遺傳變異

對采自安徽省不同地區的37個菌株的群體遺傳多樣性研究結果表明：在物種總體水平上，球孢白僵菌具有很高的多態位點百分率（PPL），PPL=83.13%（表3），平均每個位點的有效等位基因數Ne=（1.558 9±0.364 6），Nei基因多樣性指數He=（0.316 9±0.183 0），Shannon信息指數I=（0.465 7±0.250 9）。在種群水平上，各種群的多態位點百分率差異較大，其中渦陽白僵菌種群的多態位點百分率（PPL）為81.93%，Nei基因多樣性指數（He）為0.319 7，Shannon信息多樣性指數（I）為0.467 4；而蒙城白僵菌種群的多態位點百分率（PPL）為68.67%，Nei基因多樣性指數（He）為0.288 1，Shannon信息多樣性指數（I）為0.415 3；蕭縣白僵菌種群的多態位點百分率（PPL）為39.76%，Nei基因多樣性指數（He）為0.168 6，Shannon信息多樣性指數（I）為0.242 8。

2.3 球孢白僵菌種群遺傳分化程度的比較分析

用POPGENE 32計算出的遺傳變異結果表明（表4）：白僵菌各種群間存在一定的遺傳分化，3個種群總的遺傳多樣性為0.301 1，其中種群內遺傳多樣性為0.258 8，Nei基因分化系數為0.140 4，表明有14.04%的遺傳變異存在于種群間，有85.96%的遺傳變異存在于種群內，種群內的遺傳分化大于種群間的分化。種群間的基因流為1.530 8。由表3～5可以看出，三個不同種群間的基因流動及其所引起的基因分化差異較大，其中渦陽縣與蒙城縣的基因流最大（4.563 7），基因分化系數最小（0.051 9），而兩采樣點的地理位置距離為44 km。蒙城縣與蕭縣的基因流最小（1.237 1），基因分化系數最大（0.168 1），兩采樣點的地理位置距離為133 km。渦陽縣與蕭縣的基因流為1.889 7，基因分化系數為0.116 8，兩采樣點的地理位置距離為84 km。表明遺傳分化系數與地理位置沒有一定的相關性。

2.4 不同地理區域白僵菌種群的遺傳距離和遺傳一致度

利用POPGENE 32軟件對渦陽縣、蕭縣和蒙城縣3個種群兩兩種群間的Nei遺傳一致度（I）和標準遺傳距離（D）進行分析發現，不同地區間的遺傳距離（D）在0.048 8～0.124 4之間，平均為0.085 8；遺傳一致度（I）在0.883 0～0.952 4之間，平均為0.918 1（表3～6）。其中，渦陽、蒙城之間的遺傳一致度最高（0.952 4），遺傳距離最近（0.048 8）；蒙城與蕭縣之間的遺傳一致度最低（0.883 0），遺傳距離最遠（0.124 4）。

2.5 聚類分析

根據供試菌株ISSRPCR 擴增條帶的有無，以0，1記數，統計穩定、清晰出現的條帶，根據個體間的相似系數，采用NTSYSPC軟件對數據進行UPGMA聚類分析，構建37個球孢白僵菌菌株的遺傳親緣關系圖譜。

從ISSR聚類圖（圖2）可以看出，37個供試菌株在SM相似系數為0.64時聚在一起，在相似系數為0.72時明顯聚成四大類群：第一大類群（I類）包含GY1、GY2、GY18、GY11、GY4、XX1、XX12、GY16、GY7、GY12、GY19、GY14、MC14、GY22、GY23、MC13、XX3、MC11、GY15、GY17、XX5、GY25、XX6、MC2、MC10和XX13共26個菌株；第二大類群（II類）包含GY3、GY6、GY8和MC74個菌株；第三大類群（III類）是GY10、MC12、GY13、MC8和MC9 5個菌株；第四大類群（IV類）是GY9和GY20 2個菌株。其中，GY14和MC14菌株親緣關系最近，遺傳相似系數達到0.95。圖2還可以看出，37個供試菌株并沒有按照地理種群各自聚在一起，這進一步說明了種群間存在較少的遺傳變異。

3 討論與結論

ISSR分子標記與RAPD和AFLP等分子標記相比，由于其引物序列較長，退火溫度高，具有更高的重復性，且操作簡便，是一種理想的檢測種內遺傳變異的分子標記[2530]。但對于ISSR分子標記來說，不同引物的退火溫度對試驗結果的影響較大。退火溫度過低，擴增特異性差，雜帶較多，背景深；退火溫度過高，引物與模板結合差，電泳條帶弱，甚至沒有擴增。在進行0/1矩陣統計時無法區分是否是雜帶，或電泳條帶弱，肉眼很難判斷而導致一些有用位點被舍棄，雜帶計入較多，直接導致試驗結果的偏差，從而導致前期結果的偏差。本研究通過前期試驗，調整了部分引物的退火溫度。但本試驗未研究分析其他因素例如儀器型號、反應體積等可能對擴增產物的影響。

作者通過預擴增試驗從40個引物中篩選出擴增結果穩定，多態性好的11個引物對37個球孢白僵菌菌株進行了多態性擴增，分析擴增圖譜發現，ISSR引物表現出很高的遺傳多態性，多態性譜帶達到了83.13%，并且擴增結果均具有很好的重復性。因此，ISSR分子標記是研究白僵菌等蟲生真菌遺傳多樣性、群體結構等的有效方法。

采用POPGENE 32軟件對采自安徽省不同地區的37個菌株的群體遺傳多樣性進行了分析，結果顯示從安徽省3個不同地區分離的球孢白僵菌的遺傳多樣性水平較高，多態位點百分率（PPL）達到83.13%，Nei基因多樣性指數為0.316 9，Shannon信息指數為0.465 7。遺傳變異結果表明白僵菌各種群間存在一定的遺傳分化，3個種群總的遺傳多樣性為0.301 1，其中種群內遺傳多樣性為0.258 8，Nei基因分化系數為0.140 4。采用NTSYSPC軟件，根據個體間的遺傳距離構建出37個球孢白僵菌菌株的遺傳親緣關系圖譜，結果顯示37個供試菌株并沒有按照地理種群各自聚在一起，聚類組的劃分與地理來源無直接的相關性，這進一步說明了種群間存在較少的遺傳變異，分析其原因可能是供試的37個球孢白僵菌菌株均分離自玉米根際土壤，而存在于根際土壤中的球孢白僵菌會受到土壤中復雜環境因素的影響，為了適應相應的環境變化可能發生變異。本研究結果顯示渦陽種群涉及所有類群，表明該種群的遺傳異質性最高；其次是蒙城種群，不涉及第Ⅲ類群；而蕭縣種群的遺傳異質性最低，所有7個菌株全部聚在第Ⅰ大類中。

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（責任編輯：田 喆）