獼猴桃青霉病病原菌鑒定及中草藥提取物對(duì)其抑菌效果

程小梅　彭亞軍　楊玉　徐海　羅賽男　卜范文

摘要

為了解決獼猴桃真菌病害導(dǎo)致的貯運(yùn)難題，作者從湖南、陜西兩個(gè)獼猴桃主產(chǎn)區(qū)采集的病果中分離獲得青霉菌株Q1，應(yīng)用 rDNAITS 分子標(biāo)記、BLASTn比對(duì)，結(jié)合傳統(tǒng)真菌形態(tài)學(xué)鑒定，確定該致病菌為草酸青霉Pencillium oxalicum。利用帶藥培養(yǎng)基法篩選出對(duì)侵染獼猴桃的青霉菌有最佳抑制作用的中草藥提取物，獼猴桃果實(shí)采后刺傷接種Q1，研究中草藥提取物對(duì)果實(shí)病斑直徑的影響。結(jié)果表明：川芎、肉桂、高良姜的乙醇提取物對(duì)青霉均有較好的抑制效果，菌絲生長(zhǎng)相對(duì)抑制率分別達(dá)到92.79%、77.67%、78.49%，其中以川芎的抑菌效果最佳。獼猴桃果實(shí)在貯藏期接種Q1菌株后，中草藥提取物處理可顯著抑制果實(shí)病斑擴(kuò)大。

關(guān)鍵詞

獼猴桃； 青霉； 鑒定； 中草藥提取物

中圖分類號(hào)：

S436.634

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017282

Identification of the pathogen causing fruit penicilliosis on kiwifruit and the

inhibition effect of Chinese herb extracts on the pathogen

CHENG Xiaomei1，2， PENG Yajun3， YANG Yu1，2， XU Hai1，2， LUO Sainan1，2， BU Fanwen1，2

（1. Hunan Horticultural Research Institute， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， China；

2. Scientific Observation and Experiment Station of Fruit Trees in Central China， Ministry of

Agriculture， Changsha 410125， China； 3. Institute of Plant Protection， Hunan Academy of

Agricultural Sciences， Changsha 410125， China）

Abstract

The aim of this study is to solve the difficulties of fungal diseases in postharvest storage and transit of kiwifruit. The pathogen of kiwi penicilliosis was isolated from the diseased kiwifruit collected from main production areas of Hunan and Shaanxi provinces and was named Q1. Based on rDNAITS sequence analysis， BLASTn alignment and traditional morphological identification， the pathogen was identified as Pencillium oxalicum. The Chinese herb extracts with the best inhibiting effects to Pencillium oxalicum were screened by drugcontaining PDA plates， and their effects on controlling disease of kiwifruit inoculated with P.oxalicum were also investigated. The results showed that ethanol extracts of rhizoma ligusticum wallichii， cinnamon and galangal all had good inhibiting effects on P.oxalicum， with the inhibition ratio of 92.79%， 77.67%， and 78.49% on mycelial growth， respectively， among which extract of rhizoma ligustici wallichii had the best antifungal activity. During kiwifruit storage， Chinese herb extracts treatment significantly decreased the lesion diameter of kiwifruit inoculated with P.oxalicum.

Key words

kiwifruit； Penicillium； identification； Chinese herb extract

獼猴桃是一種深受消費(fèi)者喜愛(ài)的水果，營(yíng)養(yǎng)極為豐富。維生素C含量高，同時(shí)還含大量的糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等多種有機(jī)物和人體必需的多種礦物質(zhì)。獼猴桃果實(shí)青霉病是我國(guó)獼猴桃貯藏期的主要病害，在湖南、陜西等獼猴桃主產(chǎn)區(qū)發(fā)生比較普遍，癥狀為在果面受損傷處呈現(xiàn)青綠色霉層，易于識(shí)別。病原為多種青霉，主要由傷口侵入，引起腐爛。青霉不僅引起獼猴桃腐爛，還危害柑橘、蘋果、梨、哈密瓜等的葉片和果實(shí)，引起各種貯藏病害[12]。常用于水果貯藏保鮮的抗真菌作用較強(qiáng)的中草藥成分主要有丁香、木香、大黃、荊芥、肉桂、茵陳蒿、川芎、肉豆蔻、黃連、黃芩、紫草和黃柏等[37]。本研究從湖南、陜西兩大獼猴桃主產(chǎn)區(qū)采集了青霉危害的樣本，對(duì)該病菌的致病力、形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)特性進(jìn)行比較分析，同時(shí)篩選出對(duì)分離菌株有較強(qiáng)抑菌作用的中草藥提取物，以期為獼猴桃貯藏期真菌病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

獼猴桃青霉病病果采自湖南永順、鳳凰，陜西眉縣、周至4個(gè)獼猴桃主產(chǎn)區(qū)的5個(gè)果園，每個(gè)果園分別采集樣品6份，共計(jì)30份。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂20 g、蒸餾水 1 L。

試劑及儀器：PCR 擴(kuò)增儀為TaKaRa Bio Inc.生產(chǎn)的 TaKaRa Thermal Cycler DiceTP600；核酸電泳儀為ADVANCEBIO Co.， Ltd生產(chǎn)的Mupid；蛋白質(zhì)電泳儀為上海天能生產(chǎn)的EPS300；電泳成像裝置采用Pharmacia Biotech ImageMaster VDS；DNA測(cè)序儀為Applied Biosystem生產(chǎn)的ABI PRISM TM 3730XL DNA Sequencer；循環(huán)測(cè)序試劑盒采用BigDye Terminator V 3.1 Cycle Sequencing Kit；川芎、肉桂、高良姜原料均購(gòu)于安徽蜀中醫(yī)藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化、致病性測(cè)定及柯赫氏法則驗(yàn)證

將發(fā)病的果實(shí)表皮用清水清洗干凈，切取5 mm×5 mm的病組織數(shù)塊，用75%的乙醇消毒10 s，隨后放入0.1%升汞消毒5 min，取出后用無(wú)菌水沖洗3次，將病組織放入馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板中，在28℃黑暗培養(yǎng)，分離純化得到供試菌株。將分離純化的菌株在PDA平板上28℃培養(yǎng)3～5 d后用打孔器打取直徑4 mm的菌絲塊。每個(gè)處理選取健康的獼猴桃果實(shí)10個(gè)，用接種針在果實(shí)腰部將果實(shí)刺傷后將菌餅有菌絲的一面緊貼于果實(shí)傷口處，菌絲塊表面覆蓋濕棉球，放入瓷盤中密封保濕，逐日觀察各處理的發(fā)病情況。以接種不含菌PDA為對(duì)照。從接種后發(fā)病的果實(shí)上再次分離、純化和培養(yǎng)病原菌，并與原菌株進(jìn)行比較。

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

將菌株接種到PDA平板上于培養(yǎng)箱中28℃避光培養(yǎng)2 d，在顯微鏡下觀察病原菌的分生孢子形態(tài)。

1.2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

從PDA平板上用牙簽挑取少量菌體于50 μL裂解緩沖液（TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR， Code No. 9164）中，在80℃下，變性15 min，變性后離心取上清作為模板。使用TaKaRa Fungi Identification PCR Kit（Code No. RR178）擴(kuò)增目的片段。PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中，DNA模板（變性反應(yīng)液）1 μL，PCR Premix 25 μL，ITS Forward primer （20 pmol/μL） 0.5 μL，ITS Reverse primer （20 pmol/μL） 0.5 μL，ddH2O 23 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min；擴(kuò)增完畢，取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)[8]。PCR產(chǎn)物送寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序。將所得的序列提交到GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲得登錄號(hào)。同時(shí)將序列作同源相似性差異分析，確定該菌株的分類地位，用NJ法（neighborjoining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 中草藥提取物對(duì)青霉的抑菌作用

精選川芎、高良姜、肉桂原料切碎后，取肉桂粗粉各10 g。分別以乙醇為溶劑，索氏法提取3.2 h，提取液過(guò)濾，減壓回收乙醇至無(wú)醇味，熱水分散后放冷，石油醚（60～90℃）脫脂3次，水液濃縮，80℃干燥成干浸膏，粉碎成細(xì)粉供試[9]。分別配制肉桂、高良姜、川芎提取液母液330 mg/mL備用。取配制好的中草藥提取液母液與PDA培養(yǎng)基混合均勻制成濃度為8.25 mg/mL的帶藥培養(yǎng)基，將其倒入9 cm培養(yǎng)皿中，以相同量的無(wú)菌水代替中草藥母液作為對(duì)照[10]。提取物對(duì)青霉的抑菌效果采用改良的菌絲生長(zhǎng)速率法[1113]，即在含藥培養(yǎng)基中央用直徑為4 mm的打孔器打孔，注入50 μL 1.0× 106個(gè)/mL的青霉孢子懸浮液，培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)72 h后觀察試驗(yàn)結(jié)果。采用十字交叉法測(cè)量各菌落直徑，計(jì)算各處理菌落直徑的平均值和菌絲生長(zhǎng)相對(duì)抑菌率。

抑菌率=ck-cck×100%；

公式中ck為對(duì)照組菌落的凈生長(zhǎng)量，c為中草藥處理組菌落的凈生長(zhǎng)量。

1.2.5 中草藥提取物對(duì)獼猴桃果實(shí)損傷接種青霉的抑菌效果

選取外觀整齊、無(wú)病蟲害和機(jī)械損傷的獼猴桃用75%乙醇消毒，晾干備用。用接種針在果實(shí)表面穿刺接種，對(duì)照組只接種Q1病原菌，處理組先接種孢子濃度為106～107個(gè)/mL的青霉孢子懸浮液50 μL，稍晾干后接種中草藥提取物處理液，同時(shí)設(shè)有空白對(duì)照。傷口晾干后將果實(shí)放在包裝盒中，外套塑料袋保濕，于26℃貯藏。每隔2 d觀察發(fā)病率和病斑直徑。持續(xù)觀察7 d。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)8個(gè)果實(shí)，果實(shí)損傷接種后病斑直徑測(cè)量采用十字交叉法[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃青霉病病原菌的篩選分離及致病性測(cè)定

從30份樣品中共分離到6株具有較強(qiáng)致病性的青霉，健康獼猴桃接種這6株青霉后，其發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀一致，所有對(duì)照均無(wú)發(fā)病癥狀。對(duì)接種后發(fā)病的組織進(jìn)行再次分離均能得到與原來(lái)接種的菌落特征相同的分離物[15]。后續(xù)試驗(yàn)取菌株Q1進(jìn)行。

2.2 獼猴桃果實(shí)上分離青霉的形態(tài)學(xué)特征

如圖2a所示，菌株Q1在PDA培養(yǎng)基上的菌落為暗青色，粉粒狀，生長(zhǎng)速度較快，邊緣呈白色。從背面觀察培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基由淺黃色慢慢變?yōu)辄S褐色，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸加深。分生孢子呈念珠狀串生，單孢無(wú)色，近球形（圖2b）。

t

2.3 獼猴桃果實(shí)上分離青霉的分子生物學(xué)鑒定

將菌株Q1的ITS基因序列提交至GenBank，獲得登錄號(hào)MF669724。病原菌的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。菌株Q1和菌株L1為作者從獼猴桃感病果實(shí)中分離出的具有代表性的菌株。將所得序列作同源相似性分析，確定了該菌株的分類地位，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖4）表明，菌株Q1與登錄號(hào)KP735935.1和登錄號(hào)KX674635.1的同源性最高，綜合比較病原菌的形態(tài)學(xué)特征結(jié)合序列比對(duì)結(jié)果可以得出，菌株Q1為草酸青霉Penicillium oxalicum[16]。

2.4 幾種中草藥提取物對(duì)青霉的抑菌情況

表1結(jié)果可以看出肉桂、高良姜和川芎提取物均對(duì)Q1的抑菌效果良好，尤其是川芎提取物對(duì)Q1的抑菌率最高，達(dá)到了92.79%。

2.5 中草藥提取物對(duì)獼猴桃果實(shí)采后刺傷接種Q1的病斑直徑的影響

獼猴桃果實(shí)接種Q1菌株4 d后，病斑直徑不斷增加，但中草藥提取物處理顯著抑制了果實(shí)病斑的擴(kuò)大（圖5）。綜合比較川芎、高良姜、肉桂三種提取物的處理結(jié)果，川芎提取物的抑制效果最突出，高良姜提取物其次，最后為肉桂提取物。

3 結(jié)論與討論

中草藥提取物具有良好的殺菌作用，對(duì)人體和環(huán)境無(wú)危害，增加了水果食用的安全性，用于水果保鮮有很好的效果。將中草藥提取物應(yīng)用到食品防腐的最大優(yōu)點(diǎn)就是腐爛率低，很少甚至不影響食品的原有風(fēng)味。同化學(xué)合成的防腐劑相比，中草藥提取物不僅無(wú)毒，對(duì)人體健康也有裨益。再者，中草藥簡(jiǎn)單易得、取材容易、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，中草藥提取物替代化學(xué)合成保鮮劑用于水果貯藏保鮮有著廣闊的發(fā)展前景。本研究對(duì)獼猴桃青霉病病原菌進(jìn)行了篩選、鑒定，應(yīng)用 rDNAITS 分子標(biāo)記分析、BLASTn比對(duì)，結(jié)合傳統(tǒng)真菌形態(tài)學(xué)鑒定，確定致病菌Q1為草酸青霉Pencillium oxalicum。作者從眾多中草藥提取物中篩選出川芎、高良姜、肉桂三種中草藥提取物對(duì)獼猴桃青霉病病原菌抑菌效果較好，將三種抑菌效果較好的中草藥提取物用于獼猴桃果實(shí)采后刺傷接種青霉的防腐，發(fā)現(xiàn)對(duì)病斑直徑的擴(kuò)大仍有較好的抑制作用。在后續(xù)的試驗(yàn)中作者會(huì)進(jìn)一步驗(yàn)證在本試驗(yàn)中發(fā)揮抑菌作用的幾種中草藥提取物的主要抑菌成分，力爭(zhēng)將本試驗(yàn)結(jié)果可以直接應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐、解決獼猴桃貯運(yùn)難題。

參考文獻(xiàn)

[1] 閔曉芳，鄧伯勛，陳麗鋒，等.柑橘采后致病青霉的鑒定[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2007，24（5）：653656.

[2] YU Ting， LI Hongye， ZHENG Xiaodong. Synergistic effect of chitosan and Cryptococcus laurentii on inhibition of Penicillium expansum infections [J]. International Journal of Food Microbiology 2007， 114（3）： 261266.

[3] 曾榮，陳金印，張阿珊，等.植物提取液對(duì)柑桔采后青霉、綠霉抑菌活性的研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32（6）：11421145.

[4] 曾榮，張阿珊，陳金印，等.植物源防腐劑在果蔬保鮮中應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2011，7（4）：161165.

[5] 陳玉環(huán)，彭旋，陳楚英，等.三顆針提取液復(fù)合涂膜對(duì)“紐荷爾”臍橙貯藏保鮮的影響[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，38（3）：469475.

[6] 張阿珊，曾榮，陳金印，等.丁香提取液對(duì)臍橙采后生理相關(guān)酶活性的影響[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（6）：10671071.

[7] 陳楚英，陳明，陳金印，等.殼聚糖涂膜對(duì)新余蜜橘常溫貯藏保鮮效果的影響[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34（6）：11121117.

[8] 段愛(ài)莉，雷玉山，孫翔宇，等.獼猴桃果實(shí)貯藏期主要真菌病害的rDNAITS鑒定及序列分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（4）：810818.