橡膠樹速衰病的病原菌種類鑒定

蔣桂芝 陶建祥 劉一賢 施玉萍 蔡志英 李國華

摘要

橡膠樹速衰病是云南植膠區(qū)近年發(fā)生的重要病害，引起橡膠樹快速衰退后死亡。對云南主要植膠區(qū)進行速衰病調查采樣及病原菌分離鑒定，根據(jù)病原菌的形態(tài)學、培養(yǎng)特征，以及ITS1/ITS4引物擴增獲得ITS序列，鑒定其病原為可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae和茄鐮孢Fusarium solani。

關鍵詞

橡膠樹； 速衰病； 病原菌； 可可毛色二孢； 茄鐮孢

中圖分類號：

S 432.44

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017349

Identification of the pathogen species causing quick decline

diseases of rubber tree

JIANG Guizhi1， TAO Jianxiang2， LIU Yixian1， SHI Yuping1， CAI Zhiying1， LI Guohua1

（1. Yunnan Institute of Tropical Crops， Jinghong 666100， China；

2. Yunnan Natural Rubber Industry Group Jiangcheng Co.，Ltd.， Puer 665907， China）

Abstract

Quick decline diseases， which can cause the quick decline and death of rubber tree， occurring seriously in rubber plantations of Yunnan in recent years. To find out the pathogens causing rapid decline of rubber tree， the pathogens were isolated and identified according to the morphological and phylogenetic analyses. The results confirmed that the pathogens were Lasiodiplodia theobromae and Fusarium solani.

Key words

rubber tree； quick decline disease； pathogen； Lasiodiplodia theobromae； Fusarium solani

橡膠樹是我國熱帶地區(qū)重要的經濟作物，根病是橡膠生產破壞性較大的病害之一。我國植膠區(qū)已發(fā)現(xiàn)紅根病（red root rot）、褐根病（brown root rot）、紫根病（purple root rot）、臭根病（stinking root rot disease）、黑紋根病（double black lines root rot）、黑根病（black root fungus）、白根病（white root rot）等7種橡膠樹根病，而以紅根病、褐根病2種根病的經濟地位最重要[1]。長期以來一直認為我國橡膠樹死亡主要是由紅根病、褐根病引起，防治研究也以紅根病、褐根病為主。2016年4月在云南省景洪市的勐養(yǎng)農場和勐臘縣的勐滿農場進行橡膠樹根病防治藥劑試驗，分別選擇膠園中根病死亡旁邊的植株為試驗處理對象，雨季來臨后的6月開始第1次施藥，7月份第2次施藥，在施藥期間勐滿農場有3個試驗小區(qū)、勐養(yǎng)農場有2個試驗小區(qū)分別出現(xiàn)試驗植株突然死亡現(xiàn)象，其中勐滿農場的1個試驗小區(qū)試驗植株施藥后2個月內連續(xù)死亡3株，典型癥狀：葉片突然萎蔫似水燙過一樣，2～3 d后葉片開始逐漸變成黃褐色、不脫落，樹頭變黑、壞死，一周后葉片干枯，逐漸脫落（圖1a），發(fā)生嚴重的林段植株連續(xù)死亡形成病區(qū)。筆者對試驗區(qū)內植株死亡原因進行調查：挖開樹頭周圍的土，可看到樹頭已發(fā)生病變壞死，而樹干正常，死亡的樹一般是從樹頭、根部向莖干發(fā)展；經過調查，排除藥害的可能性，確定植株為真菌感染造成死亡。2016年8月至2017年3月筆者在西雙版納州景洪市的勐養(yǎng)農場、普文鎮(zhèn)，勐臘縣的勐滿農場、勐捧農場、勐醒農場，普洱地區(qū)的江城公司，紅河州河口縣的河口農場和金平農場等地的根病區(qū)進行調查，都有此類癥狀的死亡植株，嚴重的地方橡膠樹大面積死亡（圖1b），因發(fā)病突然、迅速死亡而命名為速衰病。調查發(fā)現(xiàn)速衰病樹頭壞死癥狀有2種，第一種是病變樹頭、根表面有黑色土樣物質和凝膠（圖1c），病根去皮層后可看到有黑色斑（圖1d）；第二種是病變樹頭、根表面沒有黑色土樣物質（圖1e），癥狀以第一種居多，占調查86.5%，第二種占13.5%。對各地進行了采樣，現(xiàn)將速衰病病原菌的初步研究結果進行報道。

1 材料和方法

1.1 材料

病原分離材料、鏡檢材料來源于云南省植膠區(qū)，西雙版納州景洪市勐養(yǎng)農場、普文鎮(zhèn)，勐臘縣勐滿農場、勐捧農場、勐醒農場；普洱地區(qū)的江城橡膠公司；紅河州的河口農場和金平農場等8個單位膠園；采集時間：普文鎮(zhèn)為2017年3月，其他為2016年8-9月。

1.1.1 病原分離材料

選擇癥狀典型、近期剛死亡的橡膠樹，用刀刮開感病橡膠樹樹頭表層皮，取病、健交界處大小為（0.3～0.5）cm×（0.3～0.5）cm樹皮組織作為病原分離標本，帶回實驗室進行病原分離。每單位一個膠園為1個樣點，每個樣點采3～4株，每株采樣3個。

1.1.2 鏡檢材料

挖開感病死亡樹與相鄰健康樹之間的表土，可以看到有互相交錯的根，有些健康樹朝向感病樹方向生長的根已被感染，將已感病的根帶回實驗室保濕培養(yǎng)，用于鏡檢。

1.1.3 致病性試驗材料

沒有病斑的正常橡膠樹老化葉片；在苗床上生長3～4個月的GT1實生苗；直徑25～30 cm的花盆；河沙；橡膠木屑。

1.2 方法[2]

1.2.1 病原物分離及純培養(yǎng)

將帶回的標本放在0.1%的升汞液中浸泡30 s，取出用滅菌水清洗3次，每次1 min；將清洗好的材料用滅菌的濾紙吸去多余的水分，分別置于PDA平板培養(yǎng)基上，在25～28℃室溫下培養(yǎng)，3～5 d后出現(xiàn)菌落，用滅菌針挑取少量菌絲移接到新的PDA平板上培養(yǎng)5～7 d，選取具有代表性的優(yōu)勢菌落進行單孢分離、培養(yǎng)，得到純培養(yǎng)菌種用于致病力性測試。

1.2.2 致病性測試

1.2.2.1 離體葉片接種

將正常的橡膠功能葉片用自來水清洗葉片表面，晾干葉片表面的水分后待用；將培養(yǎng)5 d的菌種用接種針劃成約0.5 cm×0.5 cm的菌塊備用；在準備好的葉片主葉脈兩邊分別錯位不對稱滴上一滴滅菌水，用大頭針在有水滴處扎3個小孔，小孔排列成三角形，然后將備好的菌塊分別放到扎孔的水滴上，把菌塊有菌絲的一面貼在葉面上，每片葉上接種2個菌塊，每個菌接種3～4片葉，最后在葉片上做好標記，放入保濕缸內在25～28℃室溫下保濕培養(yǎng)，3～5 d后取出觀察接種感病情況。葉片感病后進行病原再分離，若分離得到與所接菌種一致，即可確認為有致病力，然后進行幼苗根部接種。

1.2.2.2 幼苗根部接種

菌種準備：將干橡膠木屑1 000 g、葡萄糖200 g、可溶性淀粉200 g、水1 500 mL均勻混合，分別放入300 mL三角瓶中，每瓶裝100 g，放入高壓滅菌鍋中滅菌30 min，待瓶中的基質冷卻至室溫時，將準備好的菌株接種到基質上，在25～28℃室溫下培養(yǎng)15～20 d，待菌絲長滿基質后即作為盆栽接種的菌種。

基質：將干橡膠木屑1 000 g、葡萄糖200 g、可溶性淀粉200 g、水1 500 mL均勻混合后，放入高壓滅菌鍋中滅菌30 min，待基質冷卻至室溫待用。

盆栽接種：將2 000 g河沙+1 500 g滅菌的基質+100 g菌種（上述準備的）混合均勻后分別裝入3個花盆中，每盆栽苗4株；對照為2 000 g河沙+1 500 g滅菌的基質，分別裝入3個花盆中，每盆栽苗4株。處理和對照各栽3盆。苗栽好后放在陽臺上，淋透水1次，此后每3～4 d澆水1次，氣溫18～30℃。栽苗后第3天開始觀察，以后每隔1 d觀察1次，觀察時間至栽苗3個月。樹苗出現(xiàn)感病后進行病原再分離，若分離得到與接種一致的菌株，即確認為橡膠樹速衰病的病原菌，然后進行病原鑒定。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 形態(tài)鑒定

將經柯赫氏法則驗證的菌株在25～30℃室溫、PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d，依據(jù)菌落形態(tài)、子座形態(tài)和分生孢子形態(tài)等進行鑒定。

1.3.2 分子鑒定

使用上海生工生化科技有限公司植物基因組試劑盒進行真菌DNA提取[3]，PCR擴增產物交由上海生工生物工程技術服務有限公司完成測序。最后將該病菌的ITS序列在NCBI網(wǎng)站上進行同源性比較（BLAST），分析和確定其分類地位。

1.4 病根鏡檢

將1.2.2挖出的感病樹根帶回實驗室，用自來水清洗干凈表面的泥土，放在20～25℃、RH 70%～80%的室溫下，待樹根表層長出分生孢子后進行鏡檢。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離

8個采樣點，共采到37株，101個樣品。其中第一種癥狀（病變樹頭、根表面有黑色土樣物質和凝膠）32株96個樣品，占總采樣量的86.5%；第二種癥狀（病變樹頭、根表面沒有黑色土樣物質）的5株15個樣品，占總采樣量的13.5%，其中金平農場1株、江城橡膠公司1株、普文農場2株、勐養(yǎng)農場1株。所有標本經表面消毒處理后，在PDA平板、25～30℃室溫下培養(yǎng)。

第一種癥狀的樣品培養(yǎng)2 d后，96個樣品有92個形成白色菌落。5 d后，菌落變?yōu)榛液谏玫?0個純菌落， 另2個菌落有雜菌。培養(yǎng)至30 d鏡檢，菌株產孢，孢子形態(tài)、大小一致，隨后進行單孢分離、培養(yǎng)，得到純培養(yǎng)菌株，選取一代表性菌株編號為XJ160830，用于致病力確定。

第二種癥狀的樣品培養(yǎng)5 d，15個樣品得到香檳色菌株12個，比率為80.0%，為優(yōu)勢菌株，經鏡檢12個菌株產孢，孢子形態(tài)、大小一致，確定為同一種菌，隨后進行單孢分離、培養(yǎng)，得到純培養(yǎng)菌株，選取一代表性菌株編號為XJ160901，用于致病力確定。

2.2 致病力測試

2.2.1 離體葉片接種

在25～28℃室溫下，離體葉片分別接種2種菌株， 24 h后在接種點均形成明顯的水漬狀斑。

XJ160830接種48 h后病斑擴展直徑達到2.0 cm左右（圖2a），第3天進行病原菌再分離，在PDA平板、25～28℃室溫下培養(yǎng)3 d后得到與接種一致的菌株，確認該菌對離體葉片有致病力，進行幼苗根部接種試驗。

XJ160901菌種接種48 h后病斑擴展0.5 cm左右，第5天（圖2b）進行病原菌再分離，在PDA平板、25～28℃室溫下培養(yǎng)5 d后，得到與接種一致的菌落，確認該菌對離體葉片有致病力，進行幼苗根部接種試驗。

2.2.2 幼苗根部接種

XJ160830菌株盆栽接種：樹苗接種第8天開始出現(xiàn)葉片萎蔫，第15天植株出現(xiàn)與田間完全一致的癥狀（圖2c）。接種30 d，處理植株全部死亡；對照生長正常。將接種感病的植株進行病原分離，得到與接種一致的菌落，確認為橡膠樹速衰病的病原菌。

XJ160901菌株盆栽接種：樹苗接種第10天出現(xiàn)葉片萎蔫，第15天植株出現(xiàn)與田間完全一致的癥狀（圖2d）。接種30 d，處理植株全部死亡；對照生長正常。將接種感病的植株進行病原分離，得到與接種一致的菌落，確認為橡膠樹速衰病的病原菌。

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 形態(tài)鑒定

XJ160830：在室溫25～28℃下，菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長速度較快，菌落直徑平均日增長可達2.0 cm以上。菌落初期為白色（圖3a），以后逐漸加深而成為黑褐色（圖3b）。氣生菌絲發(fā)達，絨毛狀。新生菌絲無隔，無色透明。老化菌絲有隔，多細胞，不規(guī)則分支。在25～30℃室溫，pH 3.5的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)45 d后可形成子座，子座明顯，近球形，表面密生絨狀菌絲叢，大小為（2～3）mm×（2～3）mm。分生孢子初無色，單胞，卵圓形，基部平截，端部鈍圓，壁厚，表面光滑，成熟后變成茶褐色，中央有一隔膜，橢圓形，表面光滑，大小（9.6～14.2）μm×（20.1～23.8）μm（圖3c）。根據(jù)依據(jù)《真菌鑒定手冊》[4]和文獻[5]鑒定為可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae。

XJ160901：在25℃室溫下培養(yǎng)5 d長成的菌落呈毛氈狀，淺香檳色，菌絲緊貼培養(yǎng)基表面（圖3 d），后逐漸轉為香檳色，間有藍色或綠色。在室溫25℃下培養(yǎng)2～3 d，長出大量小型分生孢子，5～7 d后產生大型孢子。小型分生孢子多散生于菌絲間，干燥時呈粉末狀。小型分生孢子長橢圓形、卵圓形、腎形，大小為（5.8～10.3）μm×（3.0～3.4）μm；大型分生孢子一般為3～5個隔，細長，微彎，頂端彎曲較明顯，基部有足細胞，3個隔的（26.0～53.7）μm×（3.5～4.0）μm，5個隔的（35.0～58.0）μm×（4.0～5.2）μm（圖3e）；培養(yǎng)30 d，未觀察見厚垣孢子產生。分生孢子從表面的分生孢子梗上生出，分生孢子梗瓶狀，少有分枝，每個分枝的頂端是一裸露的瓶狀小梗（圖3f）。依據(jù)《真菌鑒定手冊》[4]和《The Fusarium Laboratory Manual》[6]對茄鐮孢的形態(tài)特征的描述，鑒定該病原菌為Fusarium solani。

2.3.2 分子鑒定

XJ160830：利用ITS1/ITS4引物擴增獲得527 bp ITS序列，將該ITS序列上傳至NCBI，獲得登錄號KX932435.1，在NCBI網(wǎng)站上進行同源性比較，通過BLAST搜索核酸數(shù)據(jù)庫顯示，該序列與L. theobromae L15 （登錄號KR260802.1）的ITS1，ITS2和5.8S rDNA序列相似性為99%。結合形態(tài)學鑒定結果，確認該病原菌為L. theobromae。

XJ160901：利用ITS1/ITS4引物擴增獲得548 bp ITS序列，將該ITS序列上傳至NCBI，獲得登錄號MF443133，在NCBI網(wǎng)站上進行同源性比較，通過BLAST搜索核酸數(shù)據(jù)庫顯示，該序列與F.solani DET33（登錄號KX385049.1）的ITS1，ITS2和5.8S rDNA序列相似性為99%。結合形態(tài)學鑒定結果，確認該病原菌為F. solani。

2.4 病根鏡檢

兩種癥狀的病根分別放在RH 60%～70%的室內10 d后，第一種癥狀樹根表層長出許多黑色粉狀物質，經鏡檢黑色粉狀物質為分生孢子，與XJ160830菌落培養(yǎng)產生的分生孢子的形態(tài)、大小一致，確認為可可毛色二孢；第二種癥狀樹根表層長出奶油白色霉層，經鏡檢白色霉層產生的分生孢子與XJ160901菌落培養(yǎng)產生的分生孢子的形態(tài)、大小一致，確認為茄鐮孢。

3 討論

本次調查云南主要植膠區(qū)的8個膠園，共采到37個標本，根據(jù)病原菌分離情況，L.theobromae為主要病原菌，分布廣泛；F.solani為次要病原，零星發(fā)生。L.theobromae是一個宿主范圍非常廣泛的植物病原菌，可使各種熱帶和亞熱帶地區(qū)不同寄主的樹干、根等發(fā)生病害。據(jù)國內外資料報道，L.theobromae可引起白木香枝枯[7]、肉桂枝枯[8]、高良姜葉枯[9]、葡萄藤潰瘍[1012]、桑樹根腐病[13]和橡膠樹莖干流膠病[14]等病害的發(fā)生，F(xiàn).solani引起橡膠樹割面潰瘍[15]，這兩種病原菌引起橡膠樹的根、樹頭感病死亡在國內橡膠種植上是首次報道。根病是橡膠樹重要病害之一，在我國植膠區(qū)都有發(fā)生，是影響橡膠樹平均產量提高的因素之一。據(jù)資料記載，我國已知的橡膠樹根病有7種，病原菌分別為：紅根病橡膠靈芝Ganoderma pseudoferreum、褐根病有害木層孔菌Phellinus noxius、紫根病緊密卷擔菌Helicobasidium compactum、黑根病褐臥孔菌Poria hypobrunnea、白根病木質硬孔菌Rigidoporus lignosus、黑紋根病炭色克里茲氏菌Kretzschmaria deusta、臭根病蔓球束菌Sphaerostilbe repens，其中危害較重的是紅根病、褐根病和紫根病[1]。橡膠樹感染根病地上部分癥狀總體表現(xiàn)為：樹冠稀疏，枯枝多，不抽頂芽或抽芽不均勻，葉片變小、變黃和無光澤，有的葉片還皺縮，至橡膠樹發(fā)生死亡有一個較長時間的過程。各種根病診斷的主要依據(jù)是：在病根上生長的菌絲體合并形成根狀菌索或菌膜的形態(tài)和色澤、病根的外觀、質地及氣味，生長在腐木地上部分子實體形狀及顏色。L.theobromae和F.solani引起橡膠樹根部、樹頭感病癥狀與已知橡膠樹根病癥狀有明顯區(qū)別：首先，感病植株地上部分死亡前正常，未出現(xiàn)枝枯、葉片變小、皺縮等癥狀；其次，在感病根上和樹頭未見明顯的根狀菌索或菌膜；第三，發(fā)病特點表現(xiàn)為發(fā)病急，死亡快，病害癥狀出現(xiàn)后無法挽救，即葉片突然失水萎蔫、不落葉，一周后干枯的葉片才逐漸脫落，樹干也逐漸干枯。L.theobromae和F.solani引起橡膠樹的速衰癥狀在地上部無明顯差異，主要區(qū)別在于根部和樹頭感病癥狀：L.theobromae感染在感病根上和樹頭表面可以見到煤灰樣黑色物質、凝膠等，而F.solani感染卻沒有這個特征。橡膠樹速衰病有的是發(fā)生在原來紅根病、褐根病等老根病區(qū)周圍，與紅根病、褐根病等形成混合型病區(qū)；有的是獨立發(fā)生形成病區(qū)，此類病區(qū)死亡橡膠樹殘樁上沒有子實體生長。紅根病和褐根病等已知根病死亡的樹頭殘樁上一般有子實體生長，病根有蘑菇味，而L.theobromae和F.solani引起死亡樹頭殘樁上沒有子實體，病根也無蘑菇味，這些是紅根病、褐根病等已知根病與L.theobromae和F.solani最簡單、方便的識別方法。

橡膠樹速衰病在山地一般4-11月發(fā)生，8-10月為高峰期；在冬春季有一定量的降水時，春季2-3月份也會有發(fā)生；在水分保持較好的緩坡地周年均可發(fā)生。調查橡膠樹速衰病的傳播方式時發(fā)現(xiàn)，其傳播方式與其他根病的相似：挖開感病死亡樹可以見到已經枯腐或感病嚴重的病根與樹頭相連，這是最早感病的根，同時挖開與感病死亡樹相鄰的健康樹中間根交錯的地方，多數(shù)可以發(fā)現(xiàn)有健康樹的根與病根交錯在一起，有的根已感病；將感病的根帶回實驗室進行保濕觀察，一般都能觀察到在病根表面出現(xiàn)黑色點狀物質或白色菌絲，鏡檢可分別看到可可色二孢和茄鐮孢的分生孢子；但橡膠樹速衰病較其他已知根病傳播速度快、死亡率高，對橡膠生產是極其危險的病害。調查根病區(qū)的形成過程發(fā)現(xiàn)：平地、緩坡地的發(fā)病率、傳播速度較坡地高、快，在平地，常以最早感病死亡的樹為中心向周圍輻射擴散，形成病區(qū)；在坡地，一般向左右和向下擴散形成病區(qū)，向上擴散的概率較低。根據(jù)以上調查，筆者認為橡膠樹速衰病的傳播方式主要有兩種：一是根與根接觸傳播，二是病殘體上形成的分生孢子隨雨水流動傳播。

在根病防治試驗過程中發(fā)生施藥處理后有的參試橡膠樹發(fā)生突然死亡的現(xiàn)象，在對死亡原因調查過程中發(fā)現(xiàn)了致病菌可可毛色二孢和茄鐮孢，這或許就是導致試驗結果發(fā)生異常的主要原因，同時也是云南橡膠樹根病沒有得到有效控制的原因之一。在同一根病區(qū)中既有紅根病，又有褐根病，同時還存在速衰病等不同種類根病混合發(fā)生的現(xiàn)象，因而，橡膠樹根病控制技術還需要進一步深入研究和完善。

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（責任編輯：田 喆）