兩性霉素B發酵染菌的原因分析及降低染菌率的措施

馬亦蓉

（上海上藥新亞藥業有限公司，上海201203）

0 引言

雖然兩性霉素B是由含37個碳原子組成的大環內酯乳糖七烯類的抗生素，是治療全身性深度真菌感染的唯一有效藥物，但其副作用大、毒性大，而兩性霉素B脂質體能有效彌補這一缺陷。

作為兩性霉素B脂質體的原料來源——兩性霉素B，采用生物合成法（微生物發酵法）生產，利用兩性霉素B的產生菌，在一定的條件（包括培養基、溫度、pH、通氣、攪拌等）下使其生長繁殖，并在代謝過程中產生兩性霉素B，再用溶媒結晶法將兩性霉素B從發酵液中提取出來，加以精制，最后獲得兩性霉素B成品。

兩性霉素B的生產工藝（菌種→孢子制備→種子制備→發酵）屬于發酵生產工藝。然而，發酵生產工藝要求，除大量繁殖兩性霉素B的產生菌外，不允許其他雜菌（即染菌）的生長。染菌不僅消耗培養基中的營養成分，還會分泌某些對產生菌有毒性或者能使兩性霉素B失去活性的物質。同時，降低兩性霉素B的發酵單位，嚴重時會導致“倒罐”，即發酵過程中出現了較為嚴重的染菌現象，意味著發酵失敗。因此，防止染菌，降低染菌率是發酵生產中一項長期、重要的工作。

本文從多方面入手，分析可能造成兩性霉素B發酵染菌的原因，并通過制定相應的措施，降低染菌率。

1 發酵生產簡介

1.1 工藝流程

兩性霉素B的發酵工藝流程如圖1所示。

1.2 設備流程

兩性霉素B的發酵設備流程如圖2所示。

1.3 關鍵工藝簡述

將節狀鏈霉菌（Str.nodosus）培育至生產菌株，需經種子階段、發酵階段的通氣培養，培養基由葡萄糖等原料作為碳源、酵母粉等原料作為氮源，并添加微量元素，整個培養繁殖過程應保持嚴格的純種狀態。

在整個發酵過程中，需全程進行雜菌試驗，以此來判斷發酵過程是否染菌。通過觀察菌種外觀、鏡檢等手段來判斷從一級發酵進入二級發酵（移種）的時機。兩性霉素B經過發酵周期后，發酵液經酸化過濾，收集濾餅（兩性霉素B菌絲體）。

圖1 兩性霉素B的發酵工藝流程

圖2 兩性霉素B的發酵設備流程

2 染菌事件的調查

在兩性霉素B發酵生產中發生了染菌事件，通過調查發現，其均為二級發酵間歇染菌，調查結果如表1所示，染菌情況嚴重，造成發酵效價低，過濾困難，只能作“倒罐”處理。

從表1可以看出：12批兩性霉素B發酵的染菌率為50%，染菌情況嚴峻。

3 染菌原因分析及要因確認

兩性霉素B發酵生產中的染菌原因分析及要因確認如表2所示。

在兩性霉素B發酵生產的染菌事故調查中，經過染菌原因分析及要因確認后，匯總并制成染菌原因魚刺分析圖，如圖3所示。

4 采取的控制措施

根據兩性霉素B的染菌原因魚刺分析圖，針對引發染菌的主要原因，制定相應的控制措施，如表3所示。

4.1 空氣系統中水分過多

總空氣過濾器的失效多數是由空氣系統中水分過多造成，若不能有效除濕，過濾介質極易失效，引起污染。針對這一情況，應落實專人負責空氣系統的管理，定期檢查，定時消毒，及時放出冷凝水，并對空氣在進入總過濾器之前加熱升溫，使得相對

表1 兩性霉素B發酵生產中染菌情況的調查

表2 兩性霉素B發酵生產中的染菌原因分析及要因確認

4.2 罐體滲漏

圖3 兩性霉素B的染菌原因魚刺分析圖

表3 控制措施

對發酵罐進行大范圍檢修，在罐體內電焊捉漏，檢查夾套是否腐蝕穿孔，檢查管道和連接部件安裝是否合理；對罐壁、電焊縫滲漏處作相應處理，嚴密堵漏。

4.3 罐內設計不合理

（1）針對空氣分布口偏高，影響發酵液吸收溶氧的情況，應降低空氣分布板位置，使分布口高度適宜，使發酵液有效吸收溶氧。

（2）針對罐內出料管道口距罐底距離過大，影響發酵罐清洗，從而造成發酵罐染菌的情況，應把原來高度在100mm左右出料的管道口改為基本接近罐底。

（3）針對排汽管道細，排汽不流暢，出現死角的情況，應清理旋風器，增加排汽出口，減少排汽死角。

4.4 蒸汽供應壓力低或不穩定

蒸汽供應的壓力穩定是保證發酵系統有效滅菌的基礎。若蒸汽壓力不穩定，就會因為滅菌不徹底造成污染；若蒸汽壓力低，就會造成滅菌時間長，進而破壞培養基。

一般蒸汽由動力車間供應，因此，應保證足夠壓力的飽和蒸汽及其穩定性。

4.5 滅菌操作不到位

（1）為了提高相關操作人員的素質，應對操作人員進行SOP教育培訓，并進行考核；

（2）強化管理，嚴格要求員工按照崗位SOP操作，認真控制預熱溫度、罐溫及維持罐內培養基溫度，嚴格控制進料流量，保證滅菌質量；

（3）抽查操作人員的工作情況，并與工資、獎金掛鉤。

4.6 工藝弱點

針對消毒時液面高的現象，可提高某培養基使用比例，降低另一培養基使用比例，使消毒液面得以有效控制。

5 效果檢查與對比

在針對兩性霉素B的染菌主因，制定并落實了相應的控制措施后，染菌情況大為改觀，染菌率直線下降，具體效果如表4所示。圖4為改進前后兩性霉素B的平均效價對比，圖5為改進前后兩性霉素B的染菌率對比。

圖5 改進前后兩性霉素B的染菌率對比

從表4可以看出：12批兩性霉素B發酵的染菌率為8.33%，染菌問題大有改觀。

6 結語

本文從兩性霉素B的發酵工藝入手，介紹了兩性霉素B的發酵工藝流程和設備流程，通過分析可能造成發酵染菌的原因，結合實際情況，確定了發酵染菌的主要原因，并制定了相應的控制措施，改進后的染菌情況大為改觀。

表4 改進后的染菌效果數據

圖4 改進前后兩性霉素B的平均效價對比

同時，建議采取以下鞏固措施：

（1）制定管理標準，加強對設備等的定期檢查力度，每月進行檢查、維修，發現問題及時解決；

（2）修正工藝規程，并寫入標準操作規程；

（3）制定崗位培訓計劃，對員工定期進行各項規章制度、崗位操作規程及相關文件的培訓，并嚴格遵照執行。

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