Th17細胞在過敏性哮喘發(fā)病中的作用及其與Notch信號通路的關系

盛安群 錢燕 李昌崇 張雪雅 翁翠葉 張維溪

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是兒童最常見的慢性呼吸道疾病之一，目前世界各國哮喘發(fā)病率呈明顯上升趨勢。第三次中國城市兒童哮喘流行病學調查亦顯示，我國兒童哮喘患病率由1990年的1.09%上升到2010年的3.02%，其中過敏是哮喘發(fā)病的重要原因[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)輔助性T細胞（Th）1、Th2在過敏性哮喘發(fā)病中起著重要作用，而近年來研究發(fā)現(xiàn)Th17在過敏性哮喘中發(fā)揮重要作用[2]。已有研究表明Notch信號通路在T細胞的分化和活化中發(fā)揮重要作用[3]。因此，本研究通過檢測過敏性哮喘患兒外周血中Th17細胞比例和Notch1、Notch4、維甲酸相關孤兒核受體（RORγt）mRNA表達情況，分析它們之間的相關性，明確Th17在過敏性哮喘發(fā)病中的作用及與Notch信號通路的關系，以進一步闡明過敏性哮喘的發(fā)病機制。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2016年1月至2017年2月就診于溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院、溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院專科門診及住院過敏性哮喘患兒40例（哮喘組），男18例，女22例；中位年齡7歲。兒童哮喘診斷均按照中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組制定的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》診斷標準[4]。選擇同期在溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院、溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院體檢兒童40例作為健康對照組，男17例，女23例；中位年齡7.5歲；無過敏性疾病或其他慢性病史，1周內無急性感染，無長期用藥史。入選兒童均檢測血總免疫球蛋白E（IgE）。兩組兒童性別和年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；哮喘組嗜酸性粒細胞和血總IgE均明顯高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1。本研究通過溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會、溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準和患兒家屬知情同意。

表1 兩組兒童基本資料比較

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 人淋巴細胞分離液購自荷蘭Cedarlane公司，人溶血素購自北京索萊寶科技有限公司，佛波酯、莫能霉素、離子霉素均購自美國Sigma公司，藻紅蛋白（PE）標記的抗人IL-17A抗體、IL-17的固定破膜劑均購自美國BD公司，人IL-17 ELISA試劑盒購自美國eBscience公司，引物序列由上海基康生物有限公司合成。

1.2.2 外周血Th17細胞比例檢測 Th17細胞以不同熒光標記的CD4抗體及IL-17A抗體標記后，通過流式細胞儀器檢測其在淋巴細胞中的比例。取250μl全血，用不含胎牛血清的RPMI164培養(yǎng)液1∶1等體積稀釋到500μl，在稀釋好的全血中加入50ng/ml的刺激劑佛波酯/離子霉素和 1μg/ml的轉運抑制劑布雷非德菌素A/莫能霉素，在37℃，5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6h后，實驗管加入異硫氰酸熒光素（FITC）標記的CD4抗體，對照管加入相應的同型對照抗體，避光孵育30min，加入500μl固定破膜劑，充分混勻，避光孵育30min。重懸細胞，實驗管加入PE標記的IL-17A抗體，對照管加入相應的同型對照抗體，避光孵育30min，上機檢測。

1.2.3 外周血單個核細胞Notch1、Notch4、RORγt mRNA表達水平檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測相對表達量。Ficoll密度分離法分離外周血單個核細胞，參照Trizol說明書提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，按照上游引物、下游引物、SYBR Green、Water nuclease-free反應體系進行qRT-PCR檢測，目的基因及內參的引物序列如下：GAPDH引物序列：上游引物 5′-TGGGTGGCAGTGATGGCA-3′，下游引物 5′-GGAGAAGGCTGGGGCTCAT-3′；Notch1引物序列：上游引物 5′-GCAGAACAACAGGGAGGAGA-3′，下游引物 5′-CGGTTGGCAAAGTGGTCC-3′；Notch4引物序列：上游引物5′-CTGCCCCGTGCTTCAAT-3′，下游引物5′-CAGGTTGCCCTATTCCTACAG-3′；RORγt引物序列：上游引物 5′-CAATGGAAGTGGTGCTGGTTAG-3′，下游引物 5′-TTAGGGAGTGGGAGAAGTCAAAG-3′。

1.2.4 血清IL-17水平檢測 取哮喘組和健康對照組兒童外周血清1.5ml，采用ELISA法檢測血清中IL-17水平，具體操作按試劑盒提供的說明書進行，每個樣本和標準品均設3個復孔。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。兩正態(tài)分布數(shù)據(jù)的相關性分析采用Pearson相關，兩非正態(tài)分布數(shù)據(jù)的相關性分析采用Spearman秩相關。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組兒童外周血Th17細胞比例比較 哮喘組Th17細胞比例為（1.50±0.30）%，顯著高于健康對照組的（0.93±0.24）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.2 兩組兒童Notch1、Notch4、RORγt mRNA表達水平比較 哮喘組Notch1、RORγt mRNA表達水平均顯著高于健康對照組（均P＜0.01），而兩組兒童Notch4 mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 兩組兒童Notch1、Notch4、RORγt mRNA表達水平比較

2.3 兩組兒童IL-17水平比較 哮喘組IL-17水平為2.68（2.05，3.19）pg/L，顯著高于健康對照組的 2.20（1.89，2.72）pg/L，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 Notch1 mRNA與各指標的相關性分析 哮喘組Notch1 mRNA表達水平與Th17細胞比例、RORγt mRNA表達水平、IL-17水平均呈正相關（r=0.780、0.555和0.636，均P＜0.01）。

3 討論

Th17是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新的CD4+T細胞亞群，主要分泌IL-17A、IL-17F和IL-22等細胞因子，在炎癥反應和過敏性疾病中發(fā)揮著重要作用，RORγt是其特異性的轉錄因子[5]。Peters等[6]研究發(fā)現(xiàn)致敏小鼠誘發(fā)的Th17細胞反應跟氣道重塑相關。同時Newcomb等[7]研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者的支氣管肺泡灌洗液中Th17分泌因子表達明顯增多，并且通過招募中性粒細胞、促進黏液細胞分化、促進平滑肌細胞增生參與哮喘發(fā)病。本研究亦發(fā)現(xiàn)哮喘組患兒Th17細胞比例、RORγt mRNA表達水平、IL-17水平均顯著高于健康對照組，提示Th17細胞在過敏性哮喘患兒中發(fā)揮重要作用。

生命的過程是由遺傳信息系統(tǒng)和細胞信號轉導系統(tǒng)共同調控的。從信號通路入手，能更好地闡明調控哮喘的發(fā)病機制，將為哮喘的診治提供新思路。Notch受體廣泛存在于多種生物體內，Notch信號通路參與多種組織細胞的信號識別、增殖、分化和凋亡等功能，在細胞命運的決定中起重要作用[8-9]。本研究通過qRT-PCR法檢測哮喘組患兒外周血單個核細胞中Notch受體的表達情況，發(fā)現(xiàn)哮喘組患兒Notch1 mRNA表達水平顯著高于健康對照組，但兩組Notch4 mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義，提示外周血中Notch1受體參與過敏性哮喘發(fā)病，Notch4受體未參與過敏性哮喘發(fā)病。

近年研究表明Notch信號通路在T細胞的分化和活化中發(fā)揮著重要作用，與哮喘發(fā)病關系密切[10]。Amsen等[11]發(fā)現(xiàn)抗原刺激機體抗原提呈細胞（APC）表面Notch配體的不同表達，促進了不同淋巴細胞亞群的分化，Delta信號誘導Th1細胞分化，而Jagged信號則誘導Th2細胞分化。Keerthivasan等[12]誘導Notch1基因沉默后的老鼠和人的原始CD4+T淋巴細胞向Th17細胞分化發(fā)現(xiàn)，原始CD4+T淋巴細胞向Th17細胞分化的能力明顯減弱。Jiao等[13]亦發(fā)現(xiàn)在類風濕關節(jié)炎細胞模型中，用DAPT（一種γ-促分泌酶抑制劑）作用于脾單個核細胞阻斷Notch信號通路，可減少脾單個核細胞在Ⅱ型膠原蛋白刺激下產(chǎn)生Th1、Th17細胞的能力。本研究顯示過敏性哮喘患兒Notch1 mRNA表達水平與Th17細胞比例呈正相關，說明Notch1與過敏性哮喘患兒Th17細胞具有密切的關系，Notch1可能通過促進過敏性哮喘患兒Th17細胞的表達參與哮喘的發(fā)病機制。T淋巴細胞亞群的分化依賴于相應的特定轉錄因子和不同細胞因子的作用。RORγt是Th17細胞的特異性轉錄因子，研究發(fā)現(xiàn)Notch1基因沉默后的原始CD4+T淋巴細胞在Th17誘導環(huán)境下，其RORγt mRNA表達水平明顯降低[14]。IL-17可以促進支氣管上皮細胞、支氣管成纖維細胞等分泌IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子參與氣道炎癥反應，同時這些炎癥因子可促進Th17細胞分化，從而形成正反饋，進一步促進Th17細胞的分化[15-16]。本研究亦發(fā)現(xiàn)Notch1 mRNA表達與RORγt mRNA表達水平和IL-17水平均呈正相關，提示Notch信號通路可能通過調節(jié)Th17細胞的特異性轉錄因子RORγt和主要炎癥因子IL-17表達影響Th17的分化，從而參與過敏性哮喘的病理過程。

綜上所述，Th17細胞在過敏性哮喘患兒體內發(fā)揮重要作用，Notch1受體通過影響Th17細胞表達參與過敏性哮喘患兒的發(fā)病機制。進一步深入開展Th17及Notch信號通路在過敏性哮喘患兒的作用研究，將成為哮喘治療潛在的新靶點。

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