DNA微陣列技術檢測不同HCY水平患者MTHFR基因多態性

張 婷， 胡國艷， 王華成， 許 瑩， 林裕龍

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DNA微陣列技術檢測不同HCY水平患者MTHFR基因多態性

張 婷， 胡國艷， 王華成， 許 瑩， 林裕龍

目的 檢測不同水平同型半胱氨酸(HCY)患者5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因第677核苷酸的突變頻率，探討MTHFR基因多態性與不同HCY水平的相關性。方法 以HCY大于15 μmol/L的受檢者(435例)作為實驗組，將實驗組按照HCY水平分成4組：15 μmol/L30 μmol/L為第4組，同時以HCY≤15 μmol/L的人群(229例)為對照組。用DNA微陣列技術檢測實驗組和對照組MTHFR基因第677核苷酸的突變，統計分析各組MTHFR基因型及等位基因頻率分布。結果 MTHFR基因677位核苷酸由C變異為T與HCY水平顯著相關(χ2=180.16，P<0.0001)，且隨著HCY水平升高T等位基因頻率呈增大趨勢，經線性趨勢檢驗有統計意義(χ2=156.67，P<0.0001)；同時，單獨一組與對照組比較，MTHFR基因型和等位基因頻率分布沒有顯著差異(χ2=0.031，P>0.05)。結論 MTHFR 677位等位基因由C突變為T是導致HCY水平明顯升高的重要原因，而且是導致HCY>30 μmol/L的主要原因；而HCY輕度升高(15 μmol/L

同型半胱氨酸； 亞甲基四氫葉酸還原酶； 基因型； 等位基因頻率

HCY是所有S-腺苷甲硫氨酸依賴的轉甲基化反應的產物，參與DNA沉默后調節和組蛋白翻譯后修飾的過程。血液循環中HCY升高可引發一系列疾病，包括心腦血管疾病、自身免疫性疾病、腸胃疾病、骨骼疾病和神經退行性疾病等[1]。一項Meta分析指出，空腹血中HCY每升高3 μmol/L，局部缺血性心臟病風險增加11%，腦卒中風險增加19%[2]，同時高HCY血癥也被認為是阿爾茨海默癥的獨立危險因素。因此，HCY的代謝及調節機制是目前研究的熱點之一。MTHFR是體內降解HCY的重要生物酶，MTHFR基因被認為是影響血液HCY水平最重要的遺傳因子，該基因第677位核苷酸突變非常常見，在人群中可存在3種基因型：677CC、677CT和677TT。其中677CC為野生型，677CT和677TT分別為雜合突變型和純合突變型，基因突變后所編碼的酶受熱易分解且酶活性降低，從而引起HCY升高。目前眾多醫療機構將15 μmol/L作為人群中HCY參考范圍的上限，因此本研究將HCY高于15 μmol/L的患者作為實驗組進行分組，通過分析不同HCY水平的患者MTHFR基因型及等位基因的頻率分布，探討MTHFR第677位基因變異與不同HCY水平的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 實驗組為廣州市惠愛醫院2015年2月-2015年9月住院的HCY異常患者，共435例，男363例、女72例，平均年齡(48.92±16.52)歲，HCY平均水平為(24.50±8.74)μmol/L，實驗組按HCY水平分為4組：15 μmol/L30 μmol/L為第4組。對照組為HCY正常(HCY≤15 μmol/L)的健康人群，共229例，男173例、女56例，平均年齡(47.14±15.87)歲，HCY平均水平為(12.07±2.03)μmol/L。實驗組的性別、年齡和生活環境等方面與對照組無顯著差異，且均為中國漢族人群。采集各研究對象清晨空腹靜脈血5～6 ml，其中3～4 ml置于干燥管，立即離心分離血清，1 h內檢測HCY；另1～2 ml置于EDTA抗凝管，2 ℃～8 ℃保存，3 d內提取人類基因組DNA用于MTHFR基因檢測。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 HCY檢測 AU5811全自動生化分析儀(美國貝克曼公司)，HCY試劑為北京九強公司產品。

1.2.2 MTHFR 基因多態性檢測試劑 ABI 7300實時熒光PCR擴增儀(美國ABI公司)，芯片雜交儀、芯片識讀儀以及DNA微陣列檢測MTHFR C677T基因多態性試劑盒均購自上海百傲公司。

1.3 DNA微陣列技術檢測MTHFR基因多態性

1.3.1 提取DNA模板 取EDTA抗凝全血200 μl，按DNA提取試劑盒說明書操作提取人基因組DNA。DNA樣本置-20 ℃保存，避免反復凍融。

1.3.2 PCR擴增及雜交反應 按照MTHFR基因多態性試劑盒說明書操作。

1.3.3 結果判讀 基因芯片雜交后經BE2.0芯片識讀儀掃描，根據差異的基因位點和圖譜，用Array Doctor微列陣分析軟件判定所檢測基因的基因型。

1.4 DNA測序驗證 隨機抽取各種基因型各2例，送深圳華大基因進行測序，以驗證DNA微陣列技術檢測MTHFR基因型的準確性。

1.5 統計學分析 統計方法采用“行×列的χ2檢驗”和“χ2檢驗”，由SPSS 19.0統計軟件分析完成。

2 結 果

2.1 DNA微陣列技術檢測MTHFR 677基因型與測序結果比較 隨機抽取的3種基因型各2例與測序結果比較，兩者完全一致。DNA微陣列技術檢測MTHFR 677多態性的雜交圖譜(見圖1)，DNA測序圖譜(見圖2)。

2.2 DNA微陣列技術檢測MTHFR 677基因多態性結果 MTHFR 677基因多態性結果(見表1)，經“行×列的χ2檢驗”，T等位基因頻率與HCY水平顯著相關(χ2=180.16，P<0.0001)，且隨著HCY水平升高，T等位基因頻率呈增大趨勢，經線性趨勢檢驗有統計意義(χ2=156.67，P<0.0001)。而對照組和一組(HCY輕度升高)比較，MTHFR C677T基因型分布及等位基因頻率無顯著差異(χ2=0.031，P>0.05)(見表1)。

表1 不同HCY水平的MTHFR基因型分布與等位基因頻率

備注：P1為對照組T等位基因頻率與實驗組比較，具有顯著差異；P2為對照組T等位基因頻率與第1組比較，沒有顯著差異

MTHFR 677CC MTHFR 677CT MTHFR 677TT

MTHFR 677CC MTHFR 677CT MTHFR 677TT

3 討 論

MTHFR通過不可逆地催化5,10-亞甲基四氫葉酸轉化為5-甲基四氫葉酸，后者作為甲基供體與體內的HCY結合，在蛋氨酸合成酶的催化下，使HCY轉化為蛋氨酸[3～6]。因此MTHFR的活性高低可直接影響整個反應鏈的效率。人類編碼MTHFR的基因的cDNA序列中第677位核苷酸由C到T的突變，產生一個Hinf I限制性酶切位點，造成所編碼的氨基酸由丙氨酸變成纈氨酸，這一突變可造成MTHFR的酶活性下降[5]。

為了研究HCY水平與MTHFR基因頻率分布的相關性，我們選擇了性別、年齡組成和生活環境等無顯著差異的4組實驗組和對照組。檢測不同組別人群的MTHFR基因型和等位基因頻率，結果顯示對照組、1組、2組、3組、4組的TT基因型分布為1.7%、2.4%、8.2%、21.2%和50.8%；T等位基因頻率分別為0.207、0.212、0.306、0.403和0.670。經統計分析，MTHFR 677 T等位基因頻率與HCY水平顯著相關(χ2=180.16，P<0.0001)，且表現為隨HCY水平升高T等位基因頻率顯著增大，線性趨勢檢驗有統計意義(χ2=156.67，P<0.0001)。HCY水平與MTHFR 677 T等位基因頻率呈正相關，提示MTHFR C677 T 基因T等位基因突變是引起HCY水平升高的重要原因。并且在HCY>30 μmol/L的人群，MTHFR 677 T等位基因頻率達0.670，提示MTHFR677 T等位基因是導致受檢者超高HCY水平的主要原因。

本研究中，將一組與對照組的MTHFR等位基因頻率單獨進行卡方分析，結果顯示MTHFR基因型分布和等位基因頻率沒有顯著差異(χ2=0.031，P>0.05)，這提示HCY輕度升高(HCY≤20 μmol/L)并非由MTHFR 677位基因由C突變為T導致MTHFR 酶活性改變引起，而是由其它原因所致，如代謝過程中原料不足或是其它器質性疾病等因素[7]。即使在HCY處于中等升高的受檢者中(2、3組)，T等位基因的頻率分別僅為0.306和0.403，說明MTHFR 677位基因由C突變為T并非導致這類受檢者HCY升高的主要原因，或許還存在其它較為溫和的基因突變。通過檢測MTHFR基因型以查明HCY水平升高是基因突變還是其它原因所致將有助于臨床制定相應的應對措施。

綜上所述，MTHFR基因677位核苷酸由C突變為T對HCY水平影響顯著，以HCY水平大于20 μmol/L為界的升高與MTHFR基因的突變率呈正相關，對臨床有較明確的指導價值。DNA微陣列技術可以對MTHFR基因突變進行準確快速的檢測，方便臨床對HCY升高患者進行有針對性的個體化診斷和治療。

[1]Schalinske KL,Smazal AL.Homocysteine imbalance:a pathological metabolic marker[J].Adv Nutr,2012,3(6):755-762.

[2]Smulders YM,Blom HJ.The homocysteine controversy[J].J Inherit Metab Dis,2011,34(1):93-99.

[3]Baggott JE,Tamura T.Homocysteine,iron and cardiovascular disease: a hypothesis[J].Nutrients,2015,7(2):1108-1118.

[4]Moustafa AA,Hewedi DH,Eissa AM,et al.Homocysteine levels in schizophrenia and affective disorders-focus on cognition[J].Front Behav Neurosci,2014,8:343.

[5]Keshteli AH,Baracos VE,Madsen KL.Hyperhomocysteinemia as a potential contributor of colorectal cancer development in inflammatory bowel diseases:a review[J].World J Gastroenterol,2015,21(4):1081-1090.

[6]Chakrabarti S,Khemka VK,Banerjee A,et al.Metabolic risk factors of sporadic Alzheimer’s disease:implications in the pathology,pathogenesis and treatment[J].Aging Dis,2015,6(4):282-299.

[7]Cascalheira JF,Joao SS,Pinhancos SS,et al.Serum homocysteine:interplay with other circulating and genetic factors in association to Alzheimer’s type dementia[J].Clin Biochem,2009,42(9):783-790.

Detecting the MTHFR gene polymorphism by DNA microarray technology in patients with different HCY levels

ZHANG Ting,HU Guoyan,WANG Huacheng,et al.

[Department of Laboratory Diagnosis,The Affiliated Brain Hospital of Guangzhou Medical University (Guangzhou Hui-Ai Hospital),Guangzhou 510370,China]

Objective To detect the 677th nucleotide mutation frequency of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR) gene in patients with different levels of homocysteine (HCY) and investigate correlation of MTHFR gene polymorphism and different HCY levels.Methods 435 patients whose HCY levels were higher than 15 μmol/L were selected to be experimental group and were divided into four subgroups:15 μmol/L30 μmol/L for the fourth group.229 persons whose HCY levels were less than 15 μmol/L were selected to be controls.DNA microarray technology was used to detect the 677th nucleotide mutation of MTHFR gene in all experimental objects.MTHFR genotype and allele distribution of each group were analyzed by statistical software.Results MTHFR C677T gene mutation was significantly associated with HCY level (χ2=180.16,P<0.0001).An increasing frequency of T allelic gene was associated with a significant rising of HCY levels (χ2=156.67，P<0.0001).However,there was no significant difference in MTHFR genotype and allele distribution between the first group and controls (χ2=0.031,P>0.05).Conclusion MTHFR C677T gene mutation is one of the important factors which make HCY levels rise markedly,and is a major factor for the crowds whose HCY levels are higher than 30 μmol/L.The slight increase of HCY may be caused by other reasons,not caused by mutations of MTHFR gene.

Homocysteine; Methylenetetrahydrofolate reductase; Genotype; Allele frequency

1003-2754(2016)06-489-03

2016-02-12；

2016-03-29

廣東省科技計劃項目 (No.2014A020212375)

[廣州醫科大學附屬腦科醫院(廣州市惠愛醫院)檢驗科，廣東 廣州 510370]

林裕龍，E-mail：lyl5775541@126.com

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