CX3CR1對缺血性白質的損傷作用

苗 晶， 于雪凡， 張 穎， 馮加純

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CX3CR1對缺血性白質的損傷作用

苗 晶， 于雪凡， 張 穎， 馮加純

目的 明確CX3CR1在缺血性白質中的分布與表達及與缺血性白質損傷的關系。方法 將150只成年雄性Wistar大鼠隨機分為正常組、假手術組及缺血組，采用雙側頸總動脈永久結扎法制備缺血性白質損傷模型，造模28 d后Morris水迷宮觀察學習記憶功能，同時于術后1 d、3 d、7 d、14 d、28 d觀察胼胝體、內囊及視神經的病理學變化和CX3CR1表達量的變化。結果 (1)造模后28 d，逃避潛伏期、探索路徑長度及跨越平臺次數缺血組較正常組和假手術組明顯增加，有顯著性差異(P<0.01)；(2)隨著缺血時間的延長，Luxol Fast Blue (LFB)染色可見髓鞘崩解范圍擴大，分層明顯，部分髓鞘空泡狀；CX3CR1表達量逐漸增加，與CD11b標記的小膠質細胞數目逐漸增多相一致且高于正常組和假手術組。結論 CX3CR1通過介導小膠質細胞的變化對缺血性白質產生損傷，進而影響空間學習記憶功能。

腦缺血； 白質； CX3CR1； 學習記憶

慢性腦缺血是缺血性卒中、Bingswanger病、血管性癡呆、Alzheimer病等多種疾病發生、發展過程的一個重要環節，其中白質的改變，尤其是腦室周圍和額葉皮質下的白質損傷與認知功能障礙有著密切的聯系。已有研究報道，在急性缺血、創傷、感染等疾病中，CX3CR1表達上調對機體發揮炎性損害作用[1,2]，但其在引起白質病變的研究中尚未見報道。本研究通過雙側頸總動脈永久結扎法制備缺血性白質損傷模型，觀察CX3CR1在缺血性白質中的表達，探討其與缺血性白質損傷的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及模型制備 健康雄性Wistar大鼠150只，3～4月齡，質量250～280 g，吉林大學基礎醫學院動物實驗室提供，清潔級大鼠。按隨機數字法將大鼠隨機分為正常組、假手術組、缺血組，每組50只，各組再按時間分為缺血1 d(n=10)、3 d(n=10)、7 d(n=10)、14 d(n=10)、28 d(n=10)。采用雙側頸總動脈永久結扎法制備缺血性白質損傷模型。具體方法如下：大鼠術前12 h禁食，4 h禁水。10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸部皮膚消毒去毛，頸部正中切口，分離雙側頸總動脈后用“0”號線分別結扎其遠、近端，并從中間剪斷，以確保阻斷頸總動脈供血，術后縫合切口放回籠中飼養。假手術組除不結扎、不剪斷雙側頸總動脈外，其余過程與手術組相同。

1.2 空間記憶能力測定 造模前及造模后28 d，采用Morris水迷宮法進行空間記憶能力的測定。測試程序為定位航行試驗(place navigation)：每天訓練一次，歷時5 d，將大鼠面向池壁分別從4個入水點隨機放入水中，記錄其在90 s內尋找到并爬上平臺的時間和路程，即逃避潛伏期(escape latency)。如果大鼠在90 s內未找到平臺，則由實驗者用手牽引其至平臺上，讓大鼠停留10 s，再放回籠中，潛伏期記為90 s。空間探索試驗(spatial probe)：在定位航行試驗后去除平臺，任選一個入水點，將大鼠放入池中，記錄其在90 s內跨越原平臺的次數。最后計算平均成績。

1.3 組織病理學觀察 每個時間點(各組隨機取出5只)用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)進行腹腔麻醉，取視交叉至小腦前的腦組織，用10%中性福爾馬林進行固定，常規脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、連續冠狀切片，厚度4 μm，Olympus光鏡下觀察胼胝體、內囊、視束并記錄以下指標：行LFB染色，觀察白質形態學變化。激光共聚焦顯微技術觀察CX3CR1與CD11b的分布及表達情況；行CD11b免疫組化染色，光鏡下隨機選取5個視野記錄上述部位陽性小膠質細胞數目。

1.4 Western blot蛋白印跡 每個時間點5只造模動物進行腹腔麻醉后，斷頭，冰上小心分離腦白質，進行蛋白抽提,根據Brad-ford法對蛋白質進行定量分析，測定蛋白濃度、蛋白裂解液加入4X凝膠上樣緩沖液進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。PVDF轉膜、以含5%小牛血清的PBS-T室溫封閉1 h，然后用相應的抗體(用含5%小牛血清的PBS-T配制)4 ℃孵育過夜，PBS-T洗膜3次，每次15 min。再用相應的堿性磷酸酶標記的IgG(用含5%小牛血清的PBS-T配制)室溫反應1 h，PBS-T洗膜3次，每次15 min，然后進行堿性磷酸酶顯色反應，應用凝膠成像分析系統對電泳條帶的灰度進行掃描分析。

2 結 果

2.1 行為學分析 造模前逃避潛伏期、探索路徑長度和跨越平臺次數，組間比較無統計學意義(P>0.05)；造模后28 d上述指標，缺血組較正常組比較明顯增加(P<0.01)，假手術組較正常組比較無明顯變化(P>0.05)(見表1)。

2.2 組織病理學分析

2.2.1 LFB染色顯示腦白質髓鞘病理改變 同一時間點的正常組、假手術組髓鞘清晰分布于胼胝體、內囊、外囊、扣帶回、視神經等區域，髓鞘排列整齊，無水腫、分層、斷裂及空泡形成；在缺血組，隨著缺血時間的延長，髓鞘崩解范圍逐漸擴大，部分出現空泡樣變化，其中缺血14 d時視神經，缺血28 d時胼胝體及內囊髓鞘分層、空泡化較明顯(見圖1)。

2.2.2 Western blot 結果 正常組及假手術組可以表達少量的CX3CR1；缺血組，隨著缺血時間的延長，CX3CR1表達量在28 d內持續增加，表現為：1 d時略有增加;3 d時可見增加趨勢;14 d時較明顯(P<0.01);28 d時更加顯著(P<0.01)，組間比較，存在明顯差異(見圖2、圖3)。

2.2.3 免疫組化結果 CX3CR1主要表達于細胞膜表面，此類細胞能同時在膜上表達小膠質細胞標記物CD11b(見圖4)。同一時間點的正常組及假手術組在胼胝體、內囊、視束可見少量小膠質細胞，胞體較小，沒有突起；缺血組中，隨著缺血時間的延長，不同區域小膠質細胞數目逐漸增加，且胞體變大，出現較長突起，14 d時增加明顯(P<0.05)，28 d時更趨顯著(P<0.01)，組間比較，細胞總數存在顯著性差異(見表2)。其中，缺血14 d時視神經改變較明顯(P<0.05)，缺血28 d時胼胝體改變明顯(P<0.01)，28 d時內囊也可見較明顯變化(見表3)。

表1 各組大鼠28 d空間學習記憶功能檢測結果±s)

與正常組比較*P<0.01

表2 各組不同時間點小膠質細胞總數目±s)(單位：個/視野)

與正常組比較*P<0.05,**P<0.01

表3 缺血組不同時間點不同部位小膠質細胞數目±s)(單位：個/視野)

同一部位組內比較*P<0.05,**P<0.01

圖1 缺血后白質不同區域髓鞘病理變化

圖2 各組不同時間點CX3CR1蛋白蛋白質印跡檢測結果(注：Z為正常組，S為假手術組，C為缺血組);圖3 各組不同時間點CX3CR1蛋白表達量(注：與正常組比較**P<0.01)

圖4 紅色熒光為CX3CR1；綠色熒光為CD11b；黃色熒光為二者共同表達于細胞膜上(×400)

3 討 論

近年來隨著影像學的發展，人們逐漸認識到腦白質疏松不僅是衰老過程中的部分表現，而且可以使腦卒中發生的危險性增加。因此，缺血性白質損傷成為血管性癡呆的又一個獨立危險因素。雙側頸總動脈永久性閉塞可引起白質病變，在阻塞的急性期，腦血流立即下降，并在很低的水平持續2～3 d，形成了缺血-缺氧模型。該模型在術后2.5 h可以使胼胝體的血流減少到正常的48.8%，7 d之后，血流減少到60%～75%，并在這一低水平持續很長時間[3]，同時由于大鼠Wills環發達、代償好，并沒有導致任何一個腦區血流灌注完全停止，因而在一定程度上造成腦低灌注。綜上，本研究應用雙側頸總動脈永久結扎法這一經典模型制備缺血性白質損傷模型較可靠。

CX3CR1曾被稱為V28孤兒受體，現被認為是七次跨膜G蛋白偶聯受體，當與其配體Fractalkine結合后可被激活，通過調控細胞內信號途徑發揮炎性作用[4]。Yeo等人對癲癇持續狀態大鼠腦室注射抗CX3CR1抗體，發現CX3CR1與癲癇狀態引起的炎性環境相關[5]。Clark等研究發現，CX3CR1可以通過增加突觸后膜興奮性導致慢性疼痛[2]。Shan 等通過單側黑質內注射MPP形成帕金森病模型，觀察到CX3CR1與該疾病引起的炎癥反應有關[6]。綜上，CX3CR1與多種疾病如創傷、感染、變性疾病引起的炎性機制相關，但目前關于CX3CR1與慢性缺血引起的白質損傷國內外尚無報道。本研究結果顯示，CX3CR1與缺血性白質損傷密切相關，腦組織慢性缺血后，其主要表達于小膠質細胞膜表面，且隨著缺血時間的延長，表達量逐漸增加。Jolivel等發現，在局灶性大腦中動脈閉塞模型中，cx3cr1基因敲除小鼠較雜合型小鼠梗死體積減小，血腦屏障破壞減輕[1]。Cipriani等發現替代基因cx3cr1后，急性缺血引起的腦組織損害減輕[7]，提示CX3CR1參與急性缺血引起腦組織變性壞死過程。本研究不僅發現CX3CR1與缺血相關，而且發現在尚未形成明顯壞死病灶前，與缺血引起的腦白質改變密切相關，這與病理形態學觀察結果及行為學改變相一致，可為臨床干預缺血性白質病變提供理論依據。

同時，本研究還發現隨著缺血時間的延長，表面標記CD11b的小膠質細胞數目在增加，與CX3CR1表達含量增加相一致。我們推測CX3CR1引起缺血后白質損傷的機制可能如下：Fractalkine主要表達于神經元，是在正常腦組織內唯一出現的化學趨化因子，特異性與受體CX3CR1結合抑制小膠質細胞過度激活，使其處于靜息狀態[8]；在缺血等炎性刺激時，CX3CR1表達增加會激活小膠質細胞、促進actin蛋白重聚、形態改變進而使小膠質細胞具有趨化活性，釋放炎性因子[5]；CX3CR1能作用與NF-κB產生Toll-4發揮炎性作用[7]；小膠質細胞是腦內主要的免疫細胞，CD11b標記的小膠質細胞細胞是產生IL-1β的主要的細胞，IL-1β在正常水平時，對于形成長時程增強及維持記憶功能很重要，若過度表達則可加重記憶損害[9]。因而，CX3CR1可能在缺血條件下激活小膠質細胞從而介導腦白質損傷，出現認知功能障礙，但其具體機制有待于進一步研究。此外，本研究主要觀察了CX3CR1在缺血28 d內與白質損傷的關系，至于其在缺血后期如何變化及與白質改變的關系將是我們下一步將要深入研究的課題。

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The harmful effect of CX3CR1 on white matter lesions in ischemia

MIAO Jing,YU Xuefan,ZHANG Ying,et al.

(Department of Neurology,The First Hospital of Jilin University,Changchun 130021,China)

Objective To explore the distribution and expression of CX3CR1 in ischemic white matter and the relationship between it and white matter damaging.Methods Ischemia white matter lesions (WMLs) can be introduced experimentally by permanent,bilateral common carotid artery’s occlusion( 2VO) of rats to cause chronic cerebral ischemia.150 rats were randomly divided into three groups which included normal,vehicle and ischemia groups. Their spatial learning and memory abilities were assessed using the Morris water maze on the 28th day after operation.After 1 d,3 d,7 d,14 d and 28 d for surgery,rats were sacrificed.Coronal sections in corups callosum,capsula interna and optic nerves were stained with Luxol Fast Blue (LFB) and labeled with CX3CR1 and CD11b antibodies.Expression of CX3CR1 were assessed by Western blot.Results The ischemia groups increased escape latency and swimming distance of 2VO rats from 28 d in maze tests,together with the percent time in the target quadrant (P<0.01).Coronal sections showed vacuole-shape and breakdown of myelin by LFB at corups callosum,capsula interna and optic nerves where common labeled of CX3CR1 and CD11b were observed.Expression of CX3CR1 is increasing with the ischemic time prolong.Conclusion CX3CR1 may have an effect on the ischemia brain white matter by the changing of microglia,which results in dysmnesia.

Cerebral ischemia; White matter lesions; CX3CR1; Learning and memory

1003-2754(2016)06-0536-04

2016-04-09；

2016-05-30

(吉林大學白求恩第一醫院神經內科和神經科學中心，吉林 長春 130021)

馮加純，E-mail：fengjcfrank@qq.com

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