MTHFR及TPMT基因多態性對兒童急性淋巴細胞白血病化療不良反應的影響

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2014年1月至2016年10月在本院兒內血液科確診并住院治療的漢族ALL患兒98例為研究對象。其中，男64例，女34例，年齡(5.36±2.14)歲。所有ALL患兒的診斷均符合全國兒童ALL診療建議[6]。根據臨床危險度對患兒分組[7]:高危組16例，男11例，女5例，年齡(6.03±2.26)歲；中危組39例，男27例，女12例，年齡(5.94±2.64)歲；標危組43例，男26例，女17例，年齡(5.76±2.38)歲?；純航浨捌趶娀办柟讨委煻家堰_完全緩解后進入維持治療。本研究獲醫院倫理評審委員會批準，所有患兒家長均知情同意。

1.2方法

1.2.1治療方案根據兒童CCLG-ALL2008方案，全部患兒均行大劑量(HD)-MTX+醛氫葉酸(CF)+6-MP方案化療，MTX行24 h靜脈滴注，先以10%突擊劑量在0.5 h內快速靜滴，其余90%在23.5 h內均勻滴入。中危與高危組MTX劑量為5 g/m2，標危組為3 g/m2。突擊量MTX滴后2 h內，中危與高危組以MTX、地塞米松及阿糖胞苷等三聯藥物進行1次鞘內注射，標危組以MTX進行1次鞘內注射。MTX開始42 h后以劑量為15 mg/m2的CF解救，給藥間隔為6 h，給藥頻次為6～8次。HD-MTX前5 d以大劑量水化堿化(液體總量如下：中高危3 000～4 000 mL·m-2·d-1，標危2 000～3 000 mL·m-2·d-1，總堿量130 mL·m-2·d-1)。與此同時，每天臨睡前頓服6-MP 25 mg/m2。治療期間監測24 h水量出入，并使尿pH值維持在7.0～8.0。化療時常規保護重要臟器、胃腸道與口腔黏膜。

1.2.2基因分型檢測

1.2.2.1主要試劑與儀器 QIAamp RNA Blood Mini Kit試劑盒購自天根生化科技有限公司，Reverse Transcriptase XL逆轉錄試劑盒購自大連Takara公司，瓊脂糖購自西班牙Pharmerisco公司，所有引物均由華大基因科技公司合成。主要儀器為梯度PCR檢測儀(德國Biometra公司)、核酸電泳系統(美國Bio-Rad公司)。

1.2.2.2RNA提取及cDNA制備抽取患兒外周血2 mL，EDTA抗凝并于-70 ℃保存。使用QIAamp RNA試劑盒提取總RNA，并采用Reverse Transcriptase XL逆轉錄試劑盒制備cDNA，均按試劑盒說明書操作。

1.2.2.3引物設計自Genbank獲取MTHFR及TPMT的核苷酸序列，MTHFR C677T、MTHFR A1298C的引物設計依據伍艷鵬等[8]文獻，TPMT A719G、TPMT G460A 的引物設計分別參照ASHAVAID等[9]與ZHANG等[10]的文獻。

1.2.2.4PCR擴增 MTHFR C677T與MTHFR A1298C的總反應體系為50.00 μL：去離子水17.00 μL,正向與反向引物(10 μmol/L)各2.00 μL,Mix(2×)25.00 μL,DNA模板4.00 μL。反應條件均為：95 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進行36個循環；之后72 ℃ 延伸5 min。TPMT A719G、TPMT G460A的總反應體系為50.00 μL：去離子水35.75 μL、正向與反向引物(10 μmol /L)各1.00 μL,dNTP Mix 4.00 μL,Taq 0.25 μL,緩沖液8.00 μL。反應條件均為95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環；之后72 ℃ 延伸4 min。

1.2.2.5PCR產物電泳及測序取待測PCR產物5.0 μL及Marker 7.5 μL，加入3%瓊脂糖凝膠孔內，電泳60 min，電壓為60 mV，凝膠成像系統拍照。有異常條帶的樣本原液送華大基因科技公司純化后直接測序。

1.2.3不良反應評價參照美國國立癌癥研究所常規毒性判定標準(NCI-CTC)[11]記錄研究對象化療過程中發生的不良反應，觀察指標為:黏膜損傷表現為口腔炎；胃腸道反應以腹瀉、嘔吐為主；肝臟毒性主要表現為丙氨酸氨基轉移酶及天門冬氨酸基轉移酶升高；骨髓抑制主要以血小板及血紅蛋白下降，外周血中性粒細胞降低。分級大于Ⅱ級為化療不良反應。

2 結果

2.1MTHFR基因型分布 98例ALL患兒MTHFR C677T位點：CC野生型33例(33.67%),CT雜合型46例(46.94%),TT純合型19例(19.39%)。A1298C位點：AA野生型54例(55.10%),AC雜合型32例(32.65%),CC純合型12例(12.24%)。C677T及A1298C各位點基因型在不同臨床分組中比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。ALL患兒MTHFR C677T和A1298C的突變率分別為66.33%和44.90%。

表1 ALL患兒各基因型分布[n(%)]

2.2TPMT基因型分布 98例ALL患兒TPMT A719G位點：AA野生型86例(87.76%),AG雜合型7例(7.14%)，GG純合型5例(5.10%)。TPMT G460A位點：GG野生型89例(90.82%)，GA雜合型5例(5.10%)，AA純合型4例(4.08%)。A719G及G460A各位點基因型在不同臨床分組中比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 ALL患兒TPMT A719G、G460A基因型分布[n(%)]

2.3MTHFR基因型與化療不良反應的關系 98例ALL患兒中，出現血小板減少、血紅蛋白降低和中性粒細胞減少的分別有14例(14.29%)，51例(52.04%)和78例(79.59%)，發生黏膜損傷25例(25.51%)，肝臟毒性21例(21.43%)及胃腸道反應36例(36.73%)。C677T各SNP相關化療后不良反應比較差異均無統計學意義(P>0.05);A1298AC出現血小板減少的比例(28.13%)高于A1298AA基因型(7.41%)與A1298CC基因型(8.33%)，A1298AA發生黏膜損傷的比例(9.26%)低于A1298AC基因型(43.75%)與A1298CC基因型(50.00%)，比較差異均有統計學意義(P<0.05)，其余不良反應與A1298C各SNP比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

2.4TPMT基因型與化療不良反應的關系 A719G各SNP相關化療后不良反應比較差異均無統計學意義(P>0.05)，G460A各SNP各相關不良反應比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表3 MTHFR C677T、A1298C基因多態性與化療后不良反應的關系(n)

表4 TPMT A719G、G460A基因多態性與化療后不良反應的關系(n)

3 討論

隨著眾多基因的SNP位點的發現，ALL患兒的用藥個體化與基因多態性的關系正日益得到關注，影響ALL患兒化療藥物代謝的基因多態性已被作為ALL化療不良反應與預后的預測因素?？谷~酸劑MTX是治療ALL的重要藥物，MTX經膜葉酸受體及還原葉酸載體進入細胞內，再經合成酶催化多聚谷氨酸化形成MTXPGs，從而發揮競爭性抑制二氫葉酸還原酶(DHFR)的作用，使DNA復制所必需的dTMP合成受抑制而發揮抗腫瘤作用。MTHFR是葉酸代謝相關酶，能催化亞甲基四氫葉酸轉變為甲基四氫葉酸，其催化的代謝途徑能被MTX抑制，因而MTX的不良反應及藥理作用與MTHFR的多態性關系密切[12]。6-MP是治療兒童ALL的抗嘌呤代謝藥物，通過抑制嘌呤合成途徑，競爭性抑制次黃嘌呤的轉變，并阻礙DNA合成，使淋巴細胞增殖受到抑制，是維持治療的重要藥物，但6-MP必須經過代謝生成硫鳥嘌呤核苷酸(TGNs)后才能發揮抗腫瘤活性。TPMT能將6-MP催化轉變為無活性的甲基化代謝物，從而降低穩態TGNs水平。研究顯示對6-MP敏感性低的ALL患兒在使用標準劑量藥物后因抑制作用不充分而易復發，而敏感性高的患兒則易出現不良反應，導致藥物效應差異的主要原因是藥物代謝酶基因的差異[5]。TPMT是6-MP代謝過程的關鍵酶，其基因多態性與ALL患兒的個性化劑量及不良反應也受到高度關注。

研究顯示，不同地區和種族的人群MTHFR、TPMT各SNP的突變情況及頻率有所不同。本研究結果表明，本地區ALL患兒MTHFR C677T和A1298C的突變率分別達66.33%和44.90%，與鄭苗苗等[13]、伍艷鵬等[8]研究相似。本研究TPMT A719G、G460A的突變率分別為12.24%及9.18%，高于謝茜等[5]及陳小文等[14]研究，提示中國不同地區人群可能具有特征性的基因變異。由于MTHFR在MTX與葉酸的代謝中起重要的作用，MTHFR C677T和A1298C 2個基因位點的變異可改變酶的活性，從而影響MTX的化療效應[15]。目前對于MTHFR C677T和A1298C與MTX化療不良反應的關系具有不同的觀點，LIU等[16]研究顯示677CT/TT基因型會使ALL患兒出現血小板降低的風險增加，而677TT基因型相對于677CC野生型，導致黏膜損害及肝臟毒性的風險也出現升高[17]。本研究顯示C677T各基因型出現MTX化療不良反應的差異無統計學意義，與鄭苗苗等[13]、廖清船等[18]研究一致。本研究發現A1298AC出現血小板減少的風險增加(P<0.05)，KANTAR等[19]研究顯示1298AC/CC基因型使肝毒性及骨髓抑制的風險上升。推測MTHFR A1298C多態性代謝過程中亞甲基四氫葉酸分流至DNA合成補救途徑較低，使DNA合成受到抑制，并在細胞內與MTX共同抑制二氫葉酸轉化為四氫葉酸，阻斷胸腺嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸合成，從而導致較為嚴重的不良反應。但也有研究報道A1298C SNP與MTX不良反應無顯著相關[20]。本研究顯示A1298AA出現黏膜損傷的風險下降(P<0.05)，與伍艷鵬等[8]研究一致。MTHFR A1298AA基因突變時可能將谷氨酸錯譯為丙氨酸，并增加產生胸腺核苷酸酶作用物，可合成更多的DNA從而降低不良作用。本研究顯示，TPMT A719G、G460A各SNP與化療后不良反應的出現均無明顯關聯，與謝茜等[5]研究結果一致。提示不同地區的TPMT的基因多態性可能存在差異。此外，只對2個TPMT的位點多態性進行檢測可能無法評價其與6-MP的不良反應的關系。

綜上所述，MTHFR A1298C的基因多態性可能影響ALL患兒化療出現的不良反應，臨床治療時可依據對MTHFR A1298C SNP的檢測預測患兒MTX化療后不良反應。同時，可考慮對TPMT其他基因多態性進一步檢測，明確TPMT與6-MP化療不良反應的關系，以指導ALL患兒的個體化治療?？紤]到基因多態性對ALL化療可能具有的綜合影響，還需進一步擴大樣本量，進行更加深入地研究。

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MTHFR及TPMT基因多態性對兒童急性淋巴細胞白血病化療不良反應的影響

1 資料與方法

2 結 果

3 討 論

2 結果

3 討論