內皮素A受體拮抗劑預處理對犬體外循環后腎功能的影響

白毅平，馮建國，劉 力，龍 翔，張亞兵，劉 斌

(1.西南醫科大學附屬醫院麻醉科，四川瀘州 646000；2.四川大學華西醫院麻醉科，成都 610000)

體外循環心臟術后腎損傷發生率為20%～30%，而腎損傷患者圍術期病死率為20%～80%[1]，病死率的高低與腎損傷的嚴重程度呈明顯正相關[2]。前期臨床結果提示，較體外循環(CPB)前腎臟超聲微泡造影指標而言，兒童及成人CPB術中腎臟各個區域的灌注均出現了降低[3-4]。KUMAR等[1]討論術后腎損傷與CPB期間腎灌注密切相關，并且腎損傷若早期診斷和治療可以完全恢復[5]。內皮素A受體在腎臟內僅表達在血管平滑肌上，其拮抗劑西他生坦可以高選擇性擴張腎血管，改善腎微循環。本文采用西他生坦預處理，觀察其對CPB下比格犬腎功能影響，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 雄性比格犬18只，2～4歲，10～15 kg,采用隨機數字表法分為3組(n=6)：假手術組(Sham組)全身麻醉5 h；CPB組轉機2 h并心臟復跳后觀察2 h；CPB+內皮素受體拮抗劑組(ETA組)在CPB前1 h持續泵入西他生坦0.7 mg/kg(批號：B29F7E10070,上海源葉生物科技有限公司)。

1.2方法 經上下腔及主動脈插管建立CPB，采用非搏動性灌注，淺低溫CPB(32～34 °C)，CPB期間轉機流量1.8～2.2 L·min-1·m2，維持平均動脈壓力(60～90 mm Hg)，血氣管理采用α-穩態管理策略。通過同種異體輸血維持血細胞比容(Hct)24%～28%，心肌保護采用自制HTK(細胞內)停跳液。CPB前(T1)、CPB 1 h(T2)、CPB結束(T3)、CPB后1 h(T4)、CPB后2 h(T5)采集體溫、平均動脈壓(MAP)和動脈血氣[酸堿度(pH)、二氧化碳分壓(PaCO2)、氧分壓(PaO2)、血紅蛋白(Hb)、血氧飽和度(SaO2)]；T1、T5抽取外周血監測血肌酐及尿素氮，根據KDIGO指南[6]，觀察評定急性腎損傷(AKI)。

CPB停機觀察2 h后，采集臟腎標本，分別保存于4%甲醛或-80 ℃冰箱中。腎臟標本，4%甲醛固定，脫水，石蠟包埋并切片，常規行蘇木精-伊紅(HE)染色。鏡下觀察腎臟組織病理學改變，腎小管壞死表現為刷狀緣丟失，擴張，管型形成，細胞分解。由2位有經驗的醫師依壞死腎小管所占比例對其嚴重程度進行半定量評分。評分標準：0分，正常組織，無可見明顯損傷；1分，很少量的腎小管壞死(少于10%)；2分，輕度腎小管壞死(10%～25%)；3分，中度腎小管壞死(>25%～75%)；4分，重度腎小管壞死(>75%)[7]。低溫保存腎剪取小塊組織，加入裂解液與蛋白酶抑制劑研磨、離心，Western blot測定磷酸化蛋白激酶(p-Akt)，磷酸化內皮型一氧化氮合酶(p-eNOS)蛋白水平。

2 結 果

2.13組各時間點體溫與MAP分析 CPB組和ETA組T2的體溫與MAP明顯低于T1(P<0.05)，其余時間點比較差異無統計學意義(P>0.05)；Sham組體溫與MAP各時間點比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組各時間點體溫與MAP比較

表2 3組犬動脈血氣分析比較

A：3組T1和T5時尿素氮比較；B：3組T1和T5時血肌酐比較；C：CPB組與ETA組不同等級AKI發生率。a：P<0.05，與T1比較；b：P<0.05，與CPB組比較

A：Sham組腎小管HE染色(HE，×200)；B：CPB組腎小管HE染色(HE，×200)；C：ETA組腎小管HE染色(HE，×200)；D：3組腎小管壞死評分點狀圖。箭頭顯示變性壞死的腎小管上皮細胞

A：Western blot蛋白條帶；B：p-Akt灰度值與β-actin灰度值的比值柱形圖；C：p-eNOS灰度值與β-actin灰度值的比值柱形圖。a：P<0.05，與Sham組比較；b：P<0.05，與CPB組比較

2.2動脈血氣分析 CPB組和ETA組中，與T1相比，PaO2在T2、T3時刻明顯降低，Hb在T2、T3、T4、T5時刻明顯降低(P<0.05)，其余各時間點比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.33組血肌酐、尿素氮及AKI發生率 T5時CPB組血肌酐和尿素氮明顯高于T1時(P<0.05)，T5時ETA組明顯低于CPB組(P<0.05)；ETA組的AKI發生率明顯低于CPB組(P<0.05)，見圖1。

2.4腎小管壞死評分 CPB組及ETA組腎小管壞死評分明顯高于Sham組(P<0.05)，CPB組明顯高于ETA組(P<0.05)，見圖2。

2.53組蛋白表達 與Sham組比較，CPB組及ETA組p-Akt,p-eNOS表達明顯增加(P<0.05)；與CPB組比較，ETA組p-Akt,p-eNOS表達明顯增加(P<0.05)，見圖3。

3 討 論

AKI在體外循環心臟手術中的高發生率和不良預后給患者帶來了巨大痛苦，也增加了醫院成本，更不利于社會醫療資源的合理配置[8-10]。既往有研究探討了相關防治措施，但由于發病機制不清，缺乏有效的早期檢測手段，臨床干擾因素多等原因，目前尚無有效可靠的干預手段。

本課題組[3-4]及其他課題組[11-12]研究發現，即使CPB期間正常的MAP，腎微循環灌注仍然明顯降低。O′NEIL等[13]指出，其原因可能與CPB非生理性灌注引起的腎微循環灌注改變相關，但其改變的根本原因仍有待進一步研究。任何原因造成的腎微循環灌注降低均可導致腎血管內皮系統受損，最終可致腎損傷[14]。內皮素是強有力的血管收縮劑，生理相關肽主要是ET-1，其受體ETA受體主要分布在腎血管平滑肌細胞，調節腎臟微循環；西他生坦是高選擇性ETA受體阻斷劑[15]。為此，本課題小組提出假設：西他生坦通過改善體外循環期間腎臟微循環灌注，預防CPB后AKI。

本研究發現，犬CPB期間轉機流量、MAP、Hb都在既往研究推薦的正常范圍(調節轉機流量1.8～2.2 L·min-1·m-2，維持MAP 60～90 mm Hg；Hb 70～100 g/L)[16-17]，也并未出現缺氧，但CPB后血肌酐都明顯高于CPB前。根據KDIGO指南對AKI的分級標準[6]，CPB組2只犬發生AKI，發生率為33.3%，與文獻報道結果相近(20%～30%)[18]，而西他生坦預處理后的犬，急性腎損傷發生率降為16.7%。腎微循環灌注降低會造成腎血管內皮系統受損，最終引起腎損傷[14]。GUAN等[15]研究也顯示，ETA受體阻斷劑可增加腎血流及腎小球濾過率，從而改善腎微循環灌注、減少腎損傷。本研究采用了大動物模型，且是CPB完全阻斷上下腔，更接近于臨床，得到與GUAN研究一致的結果。在進一步的HE染色病理結果中發現，給予西他生坦預處理后，腎小管水腫減輕，壞死評分明顯降低，可推斷西他生坦可能通過保護腎小管結構的穩定，從而保護腎功能。在既往的小動物非CPB缺血模型中，也有研究佐證本研究結果[19-20]。

本研究能明確觀察到西他生坦預處理CPB犬后，除了血肌酐及腎小管壞死評分降低，腎組織中p-Akt及p-eNOS蛋白表達也明顯升高。在既往缺血損傷模型中[21]，p-Akt可以活化內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，促進eNOS磷酸化，形成p-eNOS，刺激血管內皮細胞合成和釋放NO。NO可以通過彌散的方式擴散到周圍平滑肌細胞，引起平滑肌細胞松弛，舒張血管，改善微循環。NO同時又具有抗炎、細胞保護、抗氧化和調節線粒體呼吸鏈的作用[22-23]。本研究中西他生坦預處理對CPB犬腎臟的保護作用，可能與其激活Akt-eNOS信號通路，促進NO釋放，改善動物腎微循環灌注有關。本課題組計劃進一步實驗將采用影像學實時監測腎臟微循環灌注，用確切數據證實西他生坦預對微循環的改善程度。

腎損傷有功能損傷及結構損傷兩個階段[13,24]。功能損傷階段是在損傷早期由于內皮受損、炎癥因子釋放、內皮NO表達下降等因素引起一過性的毛細血管收縮導致的損傷。本課題組既往研究顯示，CPB期間腎微循環灌注降低[3-4]，術后一過性的血肌酐和尿素增加可能與這個原因相關。結構損傷是在損傷后期出現內皮細胞壞死、毛細血管缺失導致微循環障礙引起的腎損傷，繼而引起血肌酐和尿素氮升高。本課題發現CPB組血肌酐和尿素明顯升高，腎小管壞死評分也明顯升高，證明發生了結構損傷；西他生坦預處理后結構損傷得到明顯改善，可能與西他生坦激活Akt-eNOS信號通路，刺激NO合成和釋放，改善微循環相關。

綜上所述，CPB可能會導致急性腎損傷，內皮素A受體拮抗劑預處理可能通過激活Akt-eNOS信號通路，可促進NO釋放，為改善腎微循環灌注起到腎保護作用。

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