峨眉山區桑科藥用植物ITS2條形碼序列鑒定＊

任瑤瑤，張 良，謝博文，江南屏，劉睿穎，譚 睿

（西南交通大學生命科學與工程學院 成都 610031）

峨眉山位于四川盆地邊緣亞熱帶季風氣候區，峨眉山最高海拔為3 099 m，山頂山麓相對高差近2 600 m，氣候懸殊，山頂和山麓溫差大，氣溫垂直變化顯著，因而其植被分布具有明顯的垂直分布性，加之峨眉山區降雨量豐富，空氣相對濕度達80%以上，使得該區域植物資源極為豐富，多種自然要素的交匯，形成了峨眉山豐富的植物種類和復雜的區系成分[1，2]。

桑科（Moraceae）植物約有53屬1 400種，多產于熱帶、亞熱帶，少數分布在溫帶地區。我國約有12屬153種和亞種，并有變種及變型59個[3]。桑科植物中具有藥用價值的桑科植物約55種，在我國國民經濟中具有重大意義[4]。構屬（Broussonetia）藥用植物具有增強免疫[5]、消除自由基[6]、降血脂等作用[7]；桑屬（Morus）植物降血糖作用[8]、降壓降血脂作用、抗氧化作用[9]抗菌和抗病原微生物作用[10]；榕屬（Ficus Linn）植物有降血糖[11]、鎮痛抗炎[12]、抗菌[13,14]、增強免疫系統的作用。峨眉山有豐富的桑科藥用資源，桑科中許多的用植物具有藥食兩用價值，峨眉山常見的桑科藥用植物有桑（Morus alba）、地果（Ficus tikoua）、黃葛樹（Ficus virens）、冠毛榕（Ficus gasparriniana）、異葉榕（Ficus heteromorpha）、葎草（Humulus scandens）、小構樹（Broussonetia kazinoki）、構樹（Broussonetia papyrifera）等，且分布廣泛，資源較為豐富。

運用DNA條形碼技術對藥用植物進行鑒定是現在中藥鑒定研究的熱點[15]。陳士林等[16]首次提出將ITS2序列作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列。本實驗采集了峨眉山區不同地區的桑科植物樣本，并從Genbank下載同科或同屬ITS2序列，以ITS2序列作為DNA條形碼，對所有序列進行遺傳距離、barcoding gap、Neighbor Joining（NJ）系統進化樹和ITS2序列二級結構分析，對桑科藥用植物進行鑒定。通過DNA條形碼技術對桑科植物的分類進行研究，對具有藥用價值的桑科植物的研究提供基礎，同時也為進一步對峨眉山藥用植物資源的分布環境、種群量、種群動態等方面的調查分析奠定基礎。

表1 桑科植物樣本信息

1 材料

從四川省峨眉山區采集了25份桑科植物樣本，經西南交通大學生命科學與工程學院宋良科副教授鑒定，其中桑樣品6份、地果樣品3份、冠毛榕樣品4份、異葉榕4份樣品、葎草樣品2份、小構樹樣品3份、構樹樣品3份樣品信息見表1。標本保存于西南交通大學標本室。同時在GenBank數據庫中下載桑科植物ITS2序列23條，見表2。

2 方法

2.1 樣品DNA提取、PCR擴增及測序

參照任瑤瑤等[18]文章中樣品DNA提取、測序等方法，對所采集的樣本進行基因組DNA提取、ITS2片段PCR擴增及測序。

表2 GenBank下載桑科植物ITS2序列

2.2 數據處理

圖1 桑科植物樣本種間和種內距離

圖2 桑科藥用植物樣本ITS2序列種內和種間變異分布

采用CodonCode Aligner 6.0.2軟件對所得序列峰圖進行校對拼接，去除引物區和低質量的序列，由基于隱馬爾可夫模型（HMMer）的注釋方法切除ITS2兩端的5.8 S和28 S區域，獲得標準的ITS2間隔區序列[19]。所有ITS2序列用MEGA 6.0比對[20]進行種內、種間的遺傳變異分析[21]、計算K2P（Kimura 2-parameter）遺傳距離、相鄰結合法（Neighbor Joining，NJ）構建系統進化樹[22]，利用Booststrap（1000重復）檢驗各分支的支持率。利用TAXON DNA 1.8和DNAMAN 8.0軟件對所有樣本種內、種間遺傳距離進行分布頻度及樣本序列的變異程度進行分析，評價Barcoding gap。根據Koetschan等[23]建立的ITS2數據庫網站（http://its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de）預測不同種屬樣本ITS2序列的二級結構。

3 結果

3.1 變異位點及種內、種間K2P遺傳距離分析

所有ITS2序列長度為234-254 bp、GC含量58%-72%（見表1）。應用MEGA6.0軟件對所有樣品及下載序列進行多序列比對，全序列排序比對后序列長度為274 bp，種內變異位點少，種間變異位點多，其中變異位點有185個，簡約性信息位點166個，分別占總序列長度的67.52%和60.58%。

物種間種內距離越小、種間距離越大越適合條形碼鑒定[18]。參照陳士林等方法[16]，應用MEGA 6.0軟件基于K2P距離模型計算樣本種內、種間變異距離值，結果見圖1。DNAMAN軟件對比序列發現：M.mongolica與M.alba種類序列相似度為100%，種間序列相似度為99.89%，兩者種間遺傳變異較小；而F.tikoua種內序列相似度為99.50%，其種內變異程度（K2P 0.012）大于M.mongolica與M.alba種間變異程度（K2P 0.005）。此外所有樣本種內最大變異值為0.0049，所有樣本種間最小遺傳距離為0.041；由熱圖可見本實驗中桑科樣品種內、屬內顏色淺，其K2P遺傳距離較小；各屬之間遺傳距離較大，為圖中顏色較深區域；葎草屬與其他屬樣本種間遺傳變異值較大，在熱圖中所對應的區域顏色最深。分析統計樣本種內和種間遺傳距離分布（圖2）發現：樣本間存在較為明顯的barcoding gap，說明ITS 2序列對桑科樣本在種水平上鑒定能力較強；種間變異距離值主要集中在0.300-0.600區間，主要是構屬、葎草屬、榕屬之間的遺傳變異距離值組成。

3.2 NJ樹分析

利用MEGA 6.0軟件根據Kimura 2-parameter model對所有ITS2序列樣本構建Neighbor-joining（NJ）系統聚類樹（圖3），從NJ進化樹圖可以看出，各樣本屬內各單據一支，分別為榕屬、桑屬、構屬、葎草屬，分支之間靴帶檢驗法（bootstrap）支持率在90%以上；各屬內種內之間又各聚為小枝，支持率在85%以上；由NJ進化樹可見，ITS2序列能將桑科樣本在種水平上很好地分開，鑒定成功率為100%。

3.3 ITS2二級結構的分析

桑科植物樣本ITS2序列的二級結構如圖4所示，從樣本的二級結構中可以看出，ITS2二級結構相互之間均有差異，其均為一個中心環及4個螺旋區（Helix）組成，中心環大小、形狀形成差異，在螺旋區莖環（Loop）數量、形狀及大小形成差異，四個螺旋區的夾角也有明顯差異。F.pumila、H.scandens、M.alba、B.papyrifera的中心環為異形，四者二級結構主要差異在于Ⅱ螺旋區莖環的大小數量差異。因此通過ITS2二級結構可將桑科樣本中各個種較為直觀地鑒別開來。

圖3 基于ITS序列構建的桑科植物樣本的NJ樹

4 結論

DNA條形碼技術旨在建立一種準確、方便、快捷且對技術要求不高的一種生物分類鑒定方法，ITS2序列對植物具有良好的擴增成功率和物種水平的鑒定成功率[24,25]，以ITS2序列作為DNA條形碼對桑科植物的鑒定進行研究可以達到即快速又準確。本研究將峨眉山區不同地方的25份桑科植物樣本的ITS2序列分析，桑科樣本ITS2序列變異位點和簡約性信息位點在全序列中占比67.52%和60.58%，說明ITS2序列中存在大量的物種分類及進化信息，在對K2P遺傳距離分析通過桑科植物樣本種間和種內距離的熱圖可以看出種內顏色較淺、屬內顏色次之，種內和種間變異分布有明顯的barcoding gap，NJ樹可以看出桑科不同屬親緣關系較遠各聚一大支，而同屬之間親緣關系比較近，但是不同種也很明顯的各聚一小支。綜合所有樣本ITS2序列種內、種間的變異距離值、barcoding gap分析、NJ樹構建及二級結構預測等多種方法從不同方面對考察了ITS2條形碼序列對桑科植物鑒定能力，結果均表明，以ITS2序列為DNA條形碼對桑科藥用植物種水平上的鑒定能力強。

圖4 桑科ITS2序列的二級結構

峨眉山資源植物品類齊全，尤其是在藥用、食用等方面的植物資源最為豐富多樣，是我國資源植物的重要野外基因庫，為當地的社會與經濟發展提供了獨特的、重要的支撐[26]。利用DNA條形碼技術，對資源植物進行快速、準確的鑒定，對峨眉山地區藥用植物資源進行廣泛地調查和分析，并對其進行認識、保護和合理開發利用。藥用植物資源的鑒定工作固然重要，但資源管理也相當重要，將二維DNA條形碼應用于中藥材鑒定，對中藥材流通的數字化監管[27]的思路可借鑒到對藥用資源的調查中，結合分布環境，弄清種群量和種群動態等問題，正確的評價資源植物當前的狀況，在此基礎上制訂出切合實際的保護及合理開發利用的措施。

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