膠原誘導類風濕關節炎小鼠的重要臟器病理變化＊

郭晴晴，鄭 康，趙雨坤，劉 學，邱雪梅，樊丹平，呂愛平，何小鵑＊＊

（1.中國中醫科學院中醫臨床基礎醫學研究所 北京 100700；2.西南交通大學生命科學與工程學院 成都 610031；3.香港浸會大學中醫藥學院 香港 999077）

類風濕關節炎是一種慢性、系統性的自身免疫疾病，特征為多關節、對稱性、侵襲性關節炎癥，多發于手、足小關節，常伴有關節外器官受累[1,2]。類風濕關節炎病人關節的主要病理特征表現為滑膜增生、關節腔變小、炎細胞浸潤、血管翳形成、關節軟骨及軟骨下骨的破壞等[3,4]。除了關節的病理變化，還會出現多種關節外病變，例如心臟病變、肺部病變、腎臟損害等[5]。類風濕關節炎的關節病變一般只能致殘，致死罕見，但是關節外的損害有致死的可能。因此，全面了解類風濕關節炎的關節外表現有利于我們對類風濕關節炎全貌的認識，有利于避免誤診，早期治療，改善預后。

多種類風濕關節炎動物模型的建立促進了我們對類風濕關節炎發病機制及病理變化的研究和認識，特別是對關節病理的研究，但是利用動物模型研究類風濕關節炎關節外病變的較少。小鼠膠原誘導關節炎模型在臨床表現和病理機制等方面與人的類風濕關節炎有很多相似之處，是研究類風濕關節炎病理機制的較理想模型[6]。因此，我們采用牛II型膠原混合完全弗氏佐劑誘導DBA/1小鼠，觀察小鼠各個重要臟器的病理變化，以期觀察該模型是否可用于類風濕關節炎關節外病變的研究。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

20只DBA/1小鼠，雄性，7-8周，18-22 g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2012-0001，在恒溫（24±2）℃、光照周期12 h環境中飼養。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑：完全弗氏佐劑（Chondrex，Lot：150034）、牛II型膠原（Chondrex，Lot∶140519）、Mayer蘇木素染色液（LEAGENE，Lot∶0911A15）、伊紅染色液（LEAGENE，Lot∶0810A15）、UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（生工生物工程股份有限公司，Lot∶CA04KA4108）、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)（Takara，Lot∶AK3401）、SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)（Takara，Lot∶AK7103）。

主要儀器：小型高速離心機（eppendorf，型號：Cen?trifuge 5430）、渦旋振蕩儀（其林貝爾儀器制造有限公司，型號：QL-902）、熒光定量PCR儀（Applied Biosys?tems，型號：ABI7500）、包埋機（Thermo Scientific，型號：Shandon Histocentre 3）、切片機（Thermo Scientific，型號：Shandon Finesse ME+）、展片機（Thermo Scientific，型號：Tissue Flotation Bath）、烤片機（Thermo Scientific，型號：Hotplate）、正置生物顯微鏡（LEICA，型號：DM6000B）、微量紫外分光光度計（Thermo Scientific，型號：Nanodrop 2000）。

1.3 引物合成及序列

TGF-β1、TNF-α及內參基因GAPDH的上下游引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成。TGF-β1 上游引物：5′-ATTGGCCAGCATCCATCTCTTG-3′，下游引物：5′-TGCCACCATCATAGACTAG?ATTC-3′；TNF-α上游引物：5′-AGGCACTCCCCCAA AAGAT-3′，下游引物：5′-CAGTAGACAGAAGAGCGT?GGTG-3′；GAPDH上游引物：5′-AGGCCGGTGCTGAG?TATGTC-3′，下游引物：5′-TGCCTGCTTCACCACCTT CT-3′。

2 實驗方法

2.1 小鼠膠原誘導關節炎模型的制備

將DBA/1小鼠隨機分成2組，分別為正常對照組和模型組，每組10只。模型組小鼠按以下方法造模：濃度為2 mg·mL-1的牛Ⅱ型膠原溶液和完全弗氏佐劑以1∶1（體積比）的比例混合，將牛Ⅱ型膠原逐滴加入完全弗氏佐劑中，整個過程在冰浴中進行，邊滴邊用勻漿器乳化，每轉3 min，停止1 min，直至將乳化劑滴至水中，若不擴散說明已充分乳化。乳化劑需現用現配，Day 0于尾根部皮內注射，100 μL/只，Day 21用同樣的方法加強免疫[7]。

2.2 關節炎評分

造模后每周進行一次關節炎評分，評分標準如下：0分=無紅腫；1分=小趾關節紅腫；2分=趾關節和小趾關節腫脹；3分=踝關節以下部位腫脹；4分=整個足爪腫脹（包含踝關節）。每次記錄小鼠四肢的評分，累計最高評分為16分[8]。

2.3 病理學觀察

于Day63處死小鼠，分離心、肝、脾、肺、腎和踝關節。將臟器置于10%福爾馬林緩沖液中固定，將踝關節剔除周圍軟組織后置于4%多聚甲醛中固定。踝關節固定48 h后，置于10%EDTA脫鈣液中脫鈣，以1 mL注射器針頭能刺入關節骨內為脫鈣完全。將脫鈣好的踝關節用不同濃度的梯度乙醇脫水，二甲苯中透明，石蠟包埋，制作病理切片（4 μm），經蘇木素-伊紅（HE）染色后，顯微鏡下觀察各組織病理學變化。

2.4 Real-time PCR檢測小鼠肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA水平

按照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒的說明書提取小鼠肺總RNA，使用Nanodrop 2000測量RNA的純度和濃度。按照Prime Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒中的說明書將RNA反轉錄成cDNA。Real-time PCR按照SYBR?Premix Ex Taq?II(Tli RNase H Plus)試劑盒中的說明書進行操作，擴增程序為：95℃ 30 sec，（95℃ 5 sec，60℃ 40 sec）×45個循環，95℃15 sec，60℃1 min，95℃15 sec。采用2-△△CT法計算目的基因mRNA的相對表達量。

3 結果

3.1 CIA小鼠體征觀察情況

DBA/1小鼠造模成功后，毛發逐漸失去光澤，前肢、后肢陸續出現紅腫現象，功能障礙，活動減少，體重下降，Day42-63為腫脹高峰期，發病率達100%。圖1為正常小鼠和CIA發病小鼠的關節比較圖。

3.2 CIA小鼠關節炎評分結果

CIA小鼠的關節炎評分見圖2，分析可知，小鼠于Day28左右開始發病，然后關節炎評分逐漸增高，Day42-63為疾病高峰期，最高評分可達12分。

3.3 CIA小鼠踝關節和心、肝、脾、肺、腎的組織病理變化

3.3.1 踝關節病理表現

圖1 正常小鼠和CIA發病小鼠的關節比較圖

圖2 CIA小鼠關節炎評分

正常小鼠和CIA小鼠的踝關節HE染色病理圖見圖3，結果顯示：正常小鼠的踝關節結構完整，關節腔內干凈，關節表面光滑平整，滑膜細胞1-2層，排列整齊，軟骨和骨非常完整。CIA小鼠的踝關節可見滑膜增生，關節間隙明顯變窄，有關節腔積液，大量的炎細胞浸潤，血管翳形成，軟骨和軟骨下骨均有侵蝕現象。

3.3.2 心臟病理學表現

正常小鼠和CIA小鼠的心臟HE染色病理圖見圖4，結果顯示：正常小鼠的心肌組織結構清晰，心肌纖維細長，呈圓柱形，心肌纖維間有少量的結締組織。CIA小鼠的心臟病理結果和正常小鼠的相似，沒有出現明顯的病理變化。

3.3.3 肝臟病理學表現

正常小鼠和CIA小鼠的肝臟HE染色病理圖見圖5，結果顯示：正常小鼠的肝小葉結構清晰完整，肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，形態結構正常。CIA小鼠的肝臟未出現異常現象。

3.3.4 脾臟病理學表現

正常小鼠和CIA小鼠的脾臟HE染色病理圖見圖6，結果表明：正常小鼠的脾臟結構特征清晰完整，白髓和紅髓的界限比較明顯，能清楚的看到淋巴小結中央動脈以及動脈周圍的淋巴鞘，淋巴細胞密集。CIA小鼠的脾臟沒有發現明顯的病理變化。

3.3.5 肺臟病理學表現

正常小鼠和CIA小鼠的肺臟HE染色病理圖見圖7，結果顯示：正常小鼠的肺組織中肺泡的結構完整清晰，肺泡腔和支氣管腔非常干凈，有少量的紅細胞。CIA小鼠的肺部有大量的炎性細胞浸潤，肺泡間隔增厚，肺泡腔中有炎性浸出物，部分肺泡變小。

圖3 小鼠踝關節的HE染色圖（×200）

圖4 小鼠心臟的HE染色圖（×200）

圖5 小鼠肝臟的HE染色圖（×400）

圖6 小鼠脾臟的HE染色圖（×400）

圖7 小鼠肺臟的HE染色圖（×200）

3.3.6 腎臟病理學表現

圖8 小鼠腎臟的HE染色圖（×400）

圖9 小鼠肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA表達水平

正常小鼠和CIA小鼠的腎臟HE染色病理圖見圖8，結果顯示：正常小鼠的腎臟結構正常，有皮質和髓質之分，可見大量的泌尿小管，以及由少量結締組織、血管、神經等構成的腎間質，腎小管上皮細胞完好。CIA小鼠的腎臟未見明顯的病理變化。

3.4 小鼠肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA表達水平

由圖9可知，模型組小鼠肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA水平明顯高于正常組小鼠的肺組織（P＜0.01）。

4 討論

類風濕關節炎作為以滑膜炎和關節炎為主要表現的全身性疾病，經常伴有一些關節外損害[9]。本文采用牛II型膠原混合完全弗氏佐劑誘導DBA/1小鼠，成功建立了小鼠CIA模型，并觀察小鼠各個重要臟器的病理變化，以期觀察該模型是否存在關節外的并發癥。研究發現，造模成功的DBA/1小鼠除肺部有明顯病變外，肝、心、脾、腎未出現明顯的病理變化。

據臨床觀察及文獻報道，肺臟是RA患者除關節外最易受累的器官，這與肺內部豐富的結締組織及血液供應有很大關系。RA的肺部并發癥包括肺間質病變、細支氣管炎、慢性支氣管擴張、胸腔積液、類風濕結節等[1]。RA并發的呼吸系統疾病在RA患者死因中位居第二位，且近年來其死亡率呈明顯上升趨勢，其中由于類風濕關節炎間質性肺病（RA-ILD）引起的肺泡炎性肺纖維化是其死亡的直接或間接原因[10]。RA-ILD的高死亡率是由于肺部病變早期癥狀不明顯易被忽略，晚期出現癥狀后預后差[11]。因此早發現、早診斷、早治療RA合并肺部并發癥有重要意義。

間質性肺病早期肺實質細胞發生急性肺泡炎，炎癥和免疫效應細胞不斷增生、募集與活化，隨著病情發展，肺泡結構破壞，間質膠原紊亂，大量纖維組織增生，肺泡隔被破壞，形成囊性化，病變不可逆[12]。我們的研究發現CIA小鼠的肺部出現明顯的炎性病變，肺間質內有大量的炎細胞浸潤，肺泡間隔增厚，肺泡腔中有炎性浸出物，這與RA肺部并發癥的病理變化有相似之處。

RA-ILD的發病機制可能與細胞、細胞因子以及細胞外基質等因素的相互作用有關，過程復雜，仍有待進一步闡明[13]。據報道，肺富含TGF-β，誘導TGF-β活性高表達是肺間質纖維化進程啟動的重要因素之一[14,15]。此外，TNF-α等細胞因子可刺激肺內皮細胞和白細胞釋放炎性介質，進而損傷肺組織，形成肺間質纖維化[16,17]。本研究采用Real-time PCR法分別檢測病變的CIA小鼠肺組織和正常的肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA的表達水平，發現病變肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA水平顯著高于正常肺組織。

綜上所述，膠原誘導的DBA/1小鼠的肺部病變與RA肺部并發癥的病理變化及發病機制有相似之處，可以利用該模型進行RA肺部受累的研究，有利于通過動物模型進行深入的機制研究和藥效研究。

1 Gauhar U A,Gaffo A L,Alarcón G S.Pulmonary manifestations of rheu?matoid arthritis.Semin Respir Crit Care Med.2007,28(4):430-440.

2 Chen G,Lu C,Zha Q,et al.,A network-based analysis of traditional Chinese medicine cold and hot patterns in rheumatoid arthritis.Comple?ment Ther Med.2012,20(1-2):23-30.

3 Brzustewicz E,Bryl E.The role of cytokines in the pathogenesis of rheu?matoid arthritis-Practical and potential application of cytokines as bio?markers and targets of personalized therapy.Cytokine.2015,76(2):527-36.

4 趙建平,馮振宇,孟霜,等.風濕寧膠囊對類風濕關節炎大鼠Th17/Treg平衡和局部炎性因子的影響.世界科學技術-中醫藥現代化.2015,17(8):1656-1663.

5 縱瑞凱,劉健.類風濕關節炎關節外病變研究進展.中醫藥臨床雜志.2010,22(9):833-835.

6 周茹,楊以阜,左建平.Ⅱ型膠原誘導的小鼠關節炎動物模型的建立及影響因素.中國藥理學通報.2006,22(12):1532-1535.

7 Gonzalo-Gil E,Pérez-Lorenzo MJ,Galindo M,et al.Human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells ameliorate collagen-in?duced arthritis by inducing host-derived indoleamine 2,3 dioxygenase.Arthritis Res Ther.2016,18:77-86.

8 Bashi T,Shovman O,Fridkin M,et al.Novel therapeutic compound tuft?sin-phosphorylcholine attenuates collagen-induced arthritis.Clin Exp Immunol.2016,184(1):19-28.

9 Turesson C.Extra-articular rheumatoid arthritis.Curr Opin Rheumatol.2013,25(3):360-366.

10 Bongartz T,Nannini C,Medina-Velasquez Y F,et al.Incidence and mortality of interstitial lung disease in rheumatoid arthritis:a popula?tion-basedstudy.Arthritis Rheum.2010,62(6):1583-1591.

11 Yang J A,Lee J S,Park J K,et al.Clinical characteristics associated with occurrence and poor prognosis of interstitial lung disease in rheu?matoid arthritis.Korean J Intern Med.2017,28.doi:10.3904/kjim.2016.349.

12樊任珠.痹痛靈顆粒對膠原誘導關節炎關節滑膜及肺部病變血管新生影響的研究.南京:南京中醫藥大學.2011.

13 Cavagna L,Monti S,Grosso V,et al.The multifaceted aspects of intersti?tial lung disease in rheumatoid arthritis.Biomed Res Int.2013,2013：759-760.doi:10.1155/2013/759760.

14 Chu H,Shi Y,Jiang S,et al.Treatment effects of the traditional Chinese medicine Shenks in bleomycin-induced lung fibrosis through regulation of TGF-beta/Smad3 signaling and oxidative stress.Sci Rep.2017,7(1)：2252.

15 Luo Y,Xu W,Chen H,et al.A novel profibrotic mechanism mediated b TGFβ-stimulated collagen prolyl hydroxylase expression in fibrotic lung mesenchymal cells.J Pathol.2015,236(3):384-394.

16 Redente E F,Keith R C,Janssen W,et al.Tumor necrosis factor-αac?celerates the resolution of established pulmonary fibrosis in mice by tar?geting profibrotic lung macrophages.Am J Respir Cell Mol Biol.2014,50(4):825-837.

17 Colomb F,Krzewinski-Recchi M A,Steenackers A,et al.TNF up-regu?lates ST3GAL4 and sialyl-Lewisx expression in lung epithelial cells through an intronic ATF2-responsive element.Biochem J.2017,474(1):65-78.