肝脂溶顆粒對非酒精性脂肪肝模型大鼠肝臟組織PPARα表達的影響※

隋曉丹

（長春中醫藥大學附屬醫院肝脾胃病科，吉林 長春 130021）

本實驗通過觀察肝脂溶顆粒對非酒精性脂肪肝（NAFLD）模型大鼠肝臟組織PPARα表達的影響，及肝臟組織PPARα表達在NAFLD中的作用并探明調節其作用的傳導途徑，為中醫臨床干預治療非酒精性脂肪肝提供理論依據和新的思路。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 Wistar大鼠60只，雄性，體重（200±20）g。

1.2 藥物 肝脂溶顆粒：長春中醫學院附屬醫院制劑室，批準文號：長衛制藥字 (96)1367號。

多烯磷脂酰膽堿膠囊：賽諾非安萬特（北京）制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20059010。

2 實驗方法

2.1 非酒精性脂肪肝模型復制方法 大鼠適應環境1周后隨機分為正常組9只、高脂組51只。正常組予普通飼料喂養，高脂組予高脂飼料（88%基礎飼料、10%豬油、2%膽固醇）喂養，自由飲水。12周后隨機選出7只大鼠（正常組1只，高脂組6只），處死后取肝臟組織進行HE染色，驗證造模情況。

2.2 實驗動物分組及給藥方法 12周后，正常組大鼠普通飼料喂養同時每日生理鹽水灌胃。高脂組大鼠隨機分為模型組、多烯磷脂酰膽堿膠囊對照組（簡稱：對照組）、肝脂溶顆粒高、中、低劑量組（簡稱：高、中、低劑量組）。繼續高脂飼料喂養同時每日給予不同藥物進行灌胃（模型組：生理鹽水灌胃1 mL/100 g；對照組：多烯磷脂酰膽堿膠囊水溶液灌胃，按0.14 g/kg體重給藥；高劑量組：100%濃度肝脂溶顆粒水溶液灌胃，按3 g/kg體重給藥；中劑量組：70%濃度肝脂溶顆粒水溶液灌胃，按2.1 g/kg體重給藥；低劑量組：30%濃度肝脂溶顆粒水溶液灌胃，按0.9 g/kg體重給藥）。連續灌胃4周后取材。

2.3 肝臟組織標本采集 腹主動脈取血處死大鼠，打開腹腔完整分離肝臟，快速取下肝臟組織放入預先消毒的凍存管中，立即置于液氮中，保存待用。

2.4 觀察指標 RT-PCR法測定肝臟組織PPARα的表達。

2.4.1 Trizol法提取組織總RNA

2.4.2 RNA純度的測定 采用Trizol RNA法提取肝臟組織總RNA后，利用紫外分光光度計測260 nm、280 nm的紫外吸收值，計測OD260/280值，1.9～2.1為較純的RNA。

2.4.3 逆轉錄反應

2.4.4 熒光PCR反應 引物合成：PCR擴增引物由上海生物工程有限公司設計合成。見表1。

表1 引物設計

2.4.5 PCR產物的檢測和分析 取5 μLPCR產物進行2%瓊脂凝膠5 V/cm電泳，電泳結果用凝膠紫外掃描成像儀掃描，用Bandscan軟件進行圖像分析，測定各電泳帶灰度值，計算PPARα mRNA的RT-PCR產物與GAPDH mRNA的灰度比值 (V值)，作為PPARα mRNA的表達值。

PPARα mRNA相對表達量=PPARα電泳帶灰度值/GAPDH電泳帶灰度值。

2.5 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件處理數據，計量資料數據以均數加減標準差±s）表示。

3 實驗結果

半定量RT-PCR檢測大鼠肝臟PPARα mRNA水平的變化，檢測結果顯示：從肝組織PPARα相對表達量(v值)來看，正常組明顯高于其它各組 (P＜0.01)，差異有統計學意義；模型組明顯低于其它各組 (P＜0.01)，差異有統計學意義；高劑量組最接近正常組，顯著高于其它藥物干預組 (P＜0.05)，差異有統計學意義；中劑量組與對照組相比 (P＞0.05)，差異有統計學意義；低劑量組低于高、中劑量組及對照組 (P＜0.05)，差異有統計學意義。說明肝脂溶顆粒有提高肝臟組織PPARα基因表達的作用。見表2。

表2 各組大鼠16周末肝臟組織PPARα mRNA水平比較(v值)±s）

表2 各組大鼠16周末肝臟組織PPARα mRNA水平比較(v值)±s）

注：與正常組相比 *P＜0.01，**P＜0.05；與模型組相比 △P＜0.01，△△P＜0.05；與對照組相比#P＜0.05，##P＞0.05

組別 只數 PPARa mRNA正常組模型組對照組高劑量組中劑量組低劑量組8 9 8 9 8 9 2.64±0.35 0.59±0.42*1.83±0.28*△2.18±0.67*△#1.77±0.53*△##0.92±0.16*△#

圖1 PCR電泳圖

4 討論

過氧化物酶體增殖物激活受體 (PPARs)是一種較新的甾體激素類核轉錄因子，根據其結構及功能可分為α、β和γ三種亞型，PPARs[1]可以調節細胞脂肪酸代謝的各個環節，而參與脂肪酸氧化系統的一些關鍵酶均由PPARα調節，PPAR-α在脂質代謝中占有重要地位——維持體內脂質代謝的動態平衡。PPARα在肝細胞內含量較豐富，能夠通過多種途徑來保持肝細胞內的脂質內環境穩定[2]，如：調節脂蛋白的代謝，而促進肝臟對脂肪酸的攝取、轉運及氧化利用；抑制游離脂肪酸和三酰甘油的合成等。PPARα的激活還能夠通過降低體重，降低TG和FFA水平，減少機體脂肪含量及降低某些參與IR的細胞因子合成，如IL-6，TNF-a，補體C3等，從而提高全身的胰島素敏感性[3]，改善IR。PPARα功能缺陷可引起能量代謝紊亂、肝臟微血管周圍脂肪沉積、炎癥導致脂肪性肝炎[4]。因此，如PPARα缺失就會導致脂肪酸氧化減少或胰島素抵抗而導致NAFLD。

劉鐵軍教授總結多年治療非酒精性脂肪肝的臨床經驗，認為肥甘是非酒精性脂肪肝的重要病因，其形成與濕、熱、瘀、積有關。治療上，遵循《素問·至真要論》所謂“堅者消之”“結者散之”“逸者行之”“衰者補之”的法則，根據病機施以清熱利濕、化瘀消積之法。自研肝脂溶顆粒，由決明子、澤瀉、茯苓等組成。本實驗結果可見肝脂溶顆粒能增強肝臟組織PPARα mRNA表達，能在基因水平上影響肝臟脂質的合成，調節脂質代謝，促進脂肪酸氧化分解，減輕肝細胞脂質沉積，達到治療NAFLD的作用。其療效與劑量呈正相關，且增強PPARα mRNA表達水平的效果優于多烯磷脂酰膽堿膠囊。

高脂飲食誘導致NAFLD大鼠肝臟組織PPARα表達明顯減弱，這可能是大鼠引起非酒精性脂肪肝的機制之一，肝脂溶顆粒明顯增強了肝臟組織PPARαmRNA表達，因此，肝脂溶顆粒對非酒精性脂肪肝的防治作用，可能是通過增強肝臟組織PPARα mRNA表達，在基因水平上影響肝臟脂質的合成而實現的。

[1]FERRE P.The biology of peroxisome prolif erators-activated receptors:relationship with lipid metabolismand insulin sensitivity[J].Diabetes，2004（53）:43-50.

[2]EVERETTL，GALII A，CRABBD.The role ofhepatic peroxisome proliferatoractivatedreceptors(PPARs)inhealthanddisease[J].Liver，2000（20）:191-199.

[3]Rurh M，Peter HJ.The metabolic syndrome and type 2 diabetes:role of the adipocyte[J].Curr Opin Lipidol，2003，14:549-553.

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