不同炮制方法對人參皂苷含量及肝癌細胞凋亡的影響

杜瑞雪,郗艷麗,張洋婷,馮小雨,李善姬

(1.吉林醫藥學院公共衛生學院,吉林 吉林 132013;2.延邊大學醫學院,吉林 延吉 133002)

人參(Panax ginsengC.A.Meyer),是我國名貴中草藥,有“藥草之王”之稱,傳統黑參是用干鮮人參作為原材料,經九蒸九干才能制成[1]。人參皂苷是人參的主要生物活性成分,研究發現人參稀有皂苷具有腫瘤細胞殺傷作用、改善記憶力和抗炎作用[2-3]。特別是人參稀有皂苷Rg3,能夠減少肝癌細胞的增殖和轉移[4]。目前國內對黑參的研究比較少,國外有研究表明,黑參在促進新血管生成、抗氧化和抗皺等方面療效好且毒副作用小[5-6]。為了探討不同炮制方法對人參皂苷含量及抗腫瘤活性的影響,本文制人參、紅參和黑參提取液,測定人參總皂苷和稀有皂苷Rg3含量以及探討其對人肝癌細胞HepG2的增殖抑制和促凋亡作用,旨在為人參產業發展與人參保健產品開發應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 市售的五年制人參干品(產地吉林),人肝癌HepG2細胞株(吉林醫藥學院基礎醫學院提供)。正丁醇(分析純);甲醇(分析純、色譜純);乙腈(色譜純);人參皂苷Rg1,Re,Rb1,Rg3對照品(中國藥品生物制品檢定所);RPMI-1640培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜(美國GIBCO公司);四甲基偶氮唑藍(美國Sigma公司);Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 儀器與設備 Dorim DHC-7000C紅參發酵鍋(韓國);Agilent1260高效液相色譜儀(安捷倫科技);LC-20AT高效液相(日本島津公司產品);Symmetrix ODS-R C18(4.6 mm ×250 mm,5 μm)色譜柱(美國Boston Analytics公司產品);旋轉蒸發器RE-52AA(上海亞榮生化儀器廠);VP50PLUS旋轉蒸發儀(美國萊伯泰科公司);雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司);恒溫二氧化碳培養箱(Thermo);全自動酶標儀(Olympus);倒置生物顯微鏡(Olympus);流式細胞儀(美國BD公司)。

1.3 高效液相色譜條件 以乙腈為流動相A,以水為流動相B。流速:1.0 mL/min,柱溫:35℃,檢測波長為 203 nm,色譜柱:C18(4.6 ×250 mm,5 μm)。將樣品按表1的梯度洗脫條件,按測定方法測定其中的總皂苷Rg1、Re、Rb1和稀有皂苷Rg3含量。

表1 梯度洗脫條件

1.4 標準品溶液的制備及標準曲線的制作 精密稱取干燥的人參皂苷Rg1對照品4.06 mg、人參皂苷Re對照品4.38 mg、人參皂苷 Rb1對照品3.94 mg和人參皂苷Rg3對照品4.24 mg,加甲醇配制成10 mL溶液,即得 0.406 mg/mL人參皂苷 Rg1、0.438 mg/mL 人參皂苷 Re、0.394 mg/mL 人參皂苷Rb1、0.424 mg/mL 人參皂苷 Rg3的混合溶液,搖勻,用微孔過濾膜過濾備用。將標準品溶液的原液分別稀釋2倍、4倍、8倍、16倍,用HPLC法測定其峰面積,繪制標準曲線。

1.5 供試品溶液的制備 人參于紅參發酵鍋中蒸制24 h可得紅參,蒸制30 h可得黑參,自然干燥備用。人參、紅參、黑參提取液制備:在紅參發酵鍋中分別放入干燥的人參、紅參、黑參,加純凈水熬18 h制得人參、紅參、黑參提取液,過濾冷藏備用。在過濾液中加水飽和正丁醇萃取3次,收集正丁醇層,然后用旋轉蒸發儀蒸干,殘渣加甲醇溶解并轉移至5 mL量筒中,加甲醇至刻度,搖勻,過濾,即得供試品溶液。

1.6 人肝癌細胞HepG2的培養及抑制率和凋亡率檢測 細胞培養用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基,將實驗所得人參、紅參、黑參提取液用無血清RPMI-1640培養基稀釋濃度為28.8 g/L、14.4 g/L、7.2 g/L、3.6 g/L、1.8 g/L。 取對數生長期細胞,給藥組加預先配制好的各濃度藥物,置于培養箱中培養48 h。藥物作用結束后,每孔加30 μL(5 mg/mL)MTT,置培養箱內培養4 h后吸去孔內上清液,每孔加入 150 μL DMSO,全自動酶標儀于波長570 nm檢測各孔吸光度值(A)。用以下公式求藥物對細胞的抑制率:抑制率=(正常組A—給藥組A)/正常組A×l00%。凋亡率檢測時細胞用藥物處理48 h,胰酶消化并洗滌,加入100 μL的Binding Buffer緩沖液吹打均勻。加入Annexin V-FITC染液5 μL混勻,避光反應10 min,后加 PI染液5 μL,混勻避光5 min。 加入Binding Buffer緩沖液400 μL,輕輕混勻,1 h內用流式細胞儀檢測。

1.7 統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行數據處理,檢測數據以均數±標準差()表示,各組均數間比較前先進行正態性及方差齊性檢驗,若符合方差齊性,組間比較采用單因素方差分析,處理前后兩組間比較采用配對樣本t檢驗方法進行分析。選定P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同炮制方法對人參皂苷含量的影響 人參標品用HPLC法測定峰面積,繪制標準曲線,得到含量與濃度的函數,R2值良好。由圖1和表2可知,HPLC法測定的人參不同炮制方法所得提取物主要有人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rg3,根據圖1中各峰面積及標準曲線計算可得表2,結果顯示在人參炮制過程中,人參總皂苷含量由0.56%下降到0.13%,稀有皂苷 Rg3 含量由 0.17% 增加到0.30%,人參總皂苷轉化為稀有皂苷Rg3。

圖1 不同炮制方法人參皂苷含量色譜圖

表2 不同炮制方法皂苷含量變化

2.2 3種提取液對肝癌細胞的增殖抑制作用 與對照組比較,黑參組對肝癌細胞的抑制率明顯增加(P<0.05),高于紅參組和人參組,抑制率在藥物濃度為28.8 g/L時最高,濃度大于3.6 g/L時都有抑制作用,統計分析得黑參提取液的濃度—抑制率回歸方程 y=0.033 4x-0.068 9,R2=0.095 73,求得IC50=17.03 g/L。同時發現紅參提取液和人參提取液濃度低于28.8 g/L時,對HepG2細胞幾乎沒有抑制作用(表3)。

表3 三種提取液對人肝癌細胞HepG2的增值抑制作用(,n=6)

表3 三種提取液對人肝癌細胞HepG2的增值抑制作用(,n=6)

?:與對照組比較,P<0.05;-:與對照組比較,沒有抑制作用

__________黑參組 紅參組 人參組_______________________________________________________________________OD值(抑制率/%)對照組 0 0.46 ±0.06 0.45 ±0.05 0.46 ±0.04給藥組 28.8 0.07 ±0.01(84.8)? 0.36 ±0.06(20.0)? 0.34 ±0.05(26.1)?14.4 0.21 ±0.06(54.3)? 0.46 ±0.06(-) 0.55 ±0.06(-)7.2 0.41 ±0.07(10.9) 0.51 ±0.02(-) 0.69 ±0.07(-)3.6 0.45 ±0.06(2.17) 0.58 ±0.06(-) 0.61 ±0.06(-)___________________________1.8________________________________________________________________________________________________________0.46_±0.08(-)_0.52_±0.07(-)_0.82_±0.08(-)組別 濃度(g/L)

2.3 3種提取液對肝癌細胞凋亡率的影響 用Annexin V-FITC/PI雙染色法測定提取液對肝癌細胞的凋亡作用,與陰性對照組比較,黑參組顯著增加人肝癌細胞的晚期凋亡率和總凋亡率(P<0.05),且黑參組對HepG2細胞的晚期凋亡率要強于紅參組和人參組。紅參組對肝癌細胞的凋亡作用不如黑參組,但強于人參組,主要表現為增加了肝癌細胞的早期凋亡率(P<0.05),人參組對人肝癌細胞的凋亡作用不明顯。3種提取液對人肝癌細胞HepG2的凋亡率降低順序為黑參>紅參>人參(表4)。

表4 3種提取液對人肝癌細胞HepG2的凋亡率影響

表4 3種提取液對人肝癌細胞HepG2的凋亡率影響

a:與對照組早期凋亡率比較,P<0.05;b:與對照組中晚期凋亡率比較,P<0.05;c:與對照組總凋亡率比較,P<0.05

___組別 早期凋亡率/% 中晚期凋亡率/% 總凋亡率/%對照組 1.1 ±0.20 2.0 ±0.32 3.1 ±0.50黑參組 24.6 ±6.68 44.8 ±3.38b 69.4 ±8.8c紅參組 31.2 ±3.74a 20.0 ±1.95b 51.3 ±4.1c__人參組_________9.27 ±5.27_____________________________________7.63_±6.35_13.6_±5.6

3 討論

HPLC法是定性定量分析復雜化合物的常用方法,本研究通過此法分析了黑參液中總皂苷和稀有皂苷含量的變化,相較于人參和紅參,黑參中稀有皂苷的含量明顯增加,有研究表明,稀有皂苷是人參中的主要抗腫瘤成分,Wang[7]研究表明,稀有皂苷Rg5保護小鼠APAP引起的肝毒性;Shin-jung等[8]發現稀有皂苷Rg5通過調控細胞周期相關蛋白誘導乳腺癌細胞凋亡。Dong-Gun等[9]研究發現,人參稀有皂苷Rg3與其他化療藥物在抗腫瘤方面有協同作用。本試驗通過MTT法和流式細胞術比較研究明顯看出黑參的抗腫瘤活性強于紅參和人參,我們有理由懷疑黑參的抗腫瘤活性與其含有的稀有皂苷含量變化有關,在抗腫瘤研究方面可以向人參稀有皂苷方面繼續探索,為人參抗腫瘤藥物的研究提供了可行思路。

有的研究證明了黑參具有較強的抗氧化能力,也正因為如此其藥效要強于普通人參,Bak等[10]發現,黑參通過誘導抗氧化酶活性和抑制MAPK通路來保護HepG2細胞免受氧化應激。Hu[11]研究證明,黑參抑制小鼠體內肝毒性主要與其抗氧化、抗炎、抗凋亡和反硝化有關。Chen[12]發現加味黑參可以提高H22荷瘤小鼠的免疫功能,誘導腫瘤細胞凋亡。通過本次研究發現,黑參的抗氧化作用以及黑參中稀有皂苷抗腫瘤的機制還有待探討,這也成為本課題組今后的研究方向,可見黑參的藥用價值開發仍有很長的路要走。

參考文獻:

[1] Kim S J,Kim A K.Anti-breast cancer activity of Fine Black ginseng(Panax ginseng Meyer)and ginsenoside Rg5[J].J Ginseng Res.2015,39(2):125-134.

[2] Yang Z G,Sun H X,Ye Y P.Ginsenoside Rd from Panax notoginseng is cytotoxic towards HeLa cancer cells and induces apoptosis[J].Chemistry and Biodiversity,2006,3(2):187-197.

[3] Evelyn Saba,Da-Hye Jeong,Seong-Soo Roh,et al.Black ginseng-enriched Chong-Myung-Tang extracts improve spatial learning behavior in rats and elicit anti-inflammatory effects in vitro[J].J Ginseng Res,2017,41(2):151-158.

[4] Jiang J W,Chen X M,Chen X H,et al.Ginsenoside Rg3 inhibit hepatocellular carcinoma growth via intrinsic apoptotic pathway[J].World J Gastroenterol,2011,17(31):3 605-3 613.

[5] Gyu Yong Song,Kyu Jin Chung,Young Jin Shin,et al.Study on Antiangiogenic Effect of Black Ginseng Radix[J].Kor J Herbology,2011,26(3):83-90.

[6] Pham Q L,Jang H J,Kim K B.Anti-wrinkle effect of fermented black ginseng on human fibroblasts[J].Int J Mol Med,2017,39(3):681-686.

[7] Zi Wang,Jun-nan Hu,Meng-han Yan,et al.Caspase-Mediated Anti-Apoptotic Effect of Ginsenoside Rg5,a Main Rare Ginsenoside,on Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity in Mice[J].J Agric Food Chem,2017,65(42):9 226-9 236.

[8] Kim S J,Kim A K.Anti-breast cancer activity of Fine Black ginseng(Panax ginseng Meyer)and ginsenoside Rg5[J].J Ginseng Res.2015,39(2):125-134.

[9] Dong-Gun Kim,Kyung Hee Jung,Da-Gyum Lee,et al.20(S)-Ginsenoside Rg3is a novel inhibitor of autophagy and sensitizes hepatocellular carcinoma to doxorubicin[J].Oncotarget,2014,5(12):4 438-4 451.

[10] Bak M J,Jeong W S,Kim K B.Detoxifying effect of fermented black ginseng on H2O2-induced oxidative stress in HepG2 cells[J].Int J Mol Med,2014,34(6):1 516-1 522.

[11] Jun-Nan Hu,Zhi Liu,Zi Wang,et al.Ameliorative Effects and Possible Molecular Mechanism of Action of Black Ginseng(Panax ginseng)on Acetaminophen-Mediated Liver Injury[J].Molecules,2017,22(4):664.

[12] Guilin Chen,Haijun Li,Yugang Gao,et al.Flavored black ginseng exhibited antitumor activity via improving immune function and inducing apoptosis[J].Food Funct,2017,8(5):1 880-1889.