超聲波協同酶解法提取啤酒花黃酮類的工藝優化及其抗氧化試驗

王如意,李 根,姜 柳,喬 楨,倪 萍,舒 剛

(四川農業大學動物醫學院,四川 成都 611130)

啤酒花俗稱蛇麻花,是一種多年生草本蔓性植物,主要分布于北緯32°、60°之間的區域,在歐洲、亞洲和北美的分布較為集中[1]。目前已從啤酒花中分離、鑒定了400多種化合物,其中主要成分包括:α-酸、β-酸、啤酒花精油、總樹脂、多酚類以及黃酮類等化合物[2]。

黃酮類化合物是一種具有多種生理功能的生物活性物質,具有抑菌、消炎、抗過敏、抗腫瘤、抗氧化[2]等作用,能夠在一定程度上增強機體的免疫能力,抑制腫瘤細胞的擴散,延緩機體抗氧化、抗衰老,消除機體炎癥,增強心血管的功能等[3]。因此對黃酮類化合物的研究已成為當今天然植物藥物中的研究熱點。

酶解法是用酶類對植物的細胞壁進行水解,破壞植物的細胞壁結構,減少提取阻力從而提高黃酮類化合物的提取率。王曉[13]等用果膠酶和纖維素混合酶對山楂葉進行酶解后再提取,總黃酮產量提高了16.9%。目前利用超聲波法協同酶解法應用于啤酒花總黃酮的提取研究尚未見報道,本文探究了啤酒花總黃酮的超聲波法協同酶解法提取工藝,同時測定提取出的啤酒花總黃酮的抗氧化性,以期為該資源的進一步開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑與儀器 啤酒花,氧化鈉,纖維素酶140萬U/g,DPPH,維生素C。

1.2 試驗儀器 UY-2000型紫外可見分光光度計,JJ224BC型精密天平,4型電熱鼓風干燥機,HH-4型數顯恒溫水浴鍋,PB-10型酸度計,PSG60型超聲波清理器,SC-3614型低速離心機。

1.3 方法

1.3.1 試驗樣品處理方法 將啤酒花放置在50℃烘箱中烘烤3 h,待干燥后再將藥材放入配制好的乙醇溶液中浸泡。

1.3.2 樣品中總黃酮含量及黃酮提取率的測定方法 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法。

1.3.3 酶解協同超聲波法提取啤酒花黃酮工藝設計 將啤酒花放入1∶25的60%乙醇中浸泡,并添加纖維素酶2 mg/g進行酶解2 h,經40 kHz的超聲波處理30 min,靜止30 min后進行抽濾,為不影響吸光度法的應用,將濾液以3 000 r/min離心15 min,最后再測其黃酮含量。

1.4 提取啤酒花黃酮條件的優化 通過設計正交試驗對提取條件進行優化研究,確定最佳工藝條件和最佳得率。每個處理需要重復幾次,取其平均值進行分析。

1.5 啤酒花黃酮抗氧化性指標的檢測

1.5.1 啤酒花黃酮對二苯代苦味酰基自由基(DPPH)自由基的清除作用 采用DPPH清除法,對啤酒花黃酮的抗氧化性進行測定。

1.5.2 啤酒花黃酮對·OH自由基的清除作用采用·OH自由基清除法,對啤酒花黃酮的抗氧化性進行測定。

2 結果與分析

2.1 以吸光度值(A)為縱坐標,蘆丁濃度(C)為橫坐標,繪制標準曲線,得回歸方程:y=0.0108x+0.0104(R2=0.9961),表明蘆丁濃度與吸光度有良好的線性關系,并用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定啤酒花黃酮的含量,進而計算啤酒花總黃酮得率。

以酶解時間(1.5 h、2 h、2.5 h),酶解溫度(40 ℃、45 ℃、50 ℃),酶解 pH 值(3.5、4.0、4.5)為三因素正交試驗設計,試驗結果表1。

表1 正交實驗結果

將最佳工藝重復3次提取啤酒花黃酮,總黃酮最高總得率為55.7(mg/g),超聲波協同酶解法可以有效地提取啤酒花中的黃酮類物質,由正交試驗設計結果可知,影響黃酮提取效果的3種因素中,其對得率的影響因素大小排序依次為酶解時間>酶解pH值>酶解溫度。最佳的提取工藝為在pH值為4,酶解溫度為30℃的情況下酶解時間1.5 h,最高的總黃酮得率為55.7(mg/g)。

2.2 抗氧化活性測定 隨著啤酒花總黃酮濃度的提高,對DPPH清除效果明顯提高。當質量濃度為2 mg/mL時,清除率達94.3%。啤酒花總黃酮對·OH有較好的清除能力。在質量濃度為2 mg/mL時,其對·OH的清除率可達89.3%。

3 結論與討論

本試驗著眼于啤酒花中黃酮類化合物提取工藝的優化,首次利用超聲波協同酶解法提取啤酒花中黃酮類物質,相比于傳統的有機溶劑浸漬法,例如用乙醇提取啤酒花黃酮可達38.5 mg/g,本研究中建立的方法大大的提高了黃酮類物質的提取率,總黃酮得最高的率可達55.7 mg/g。因超聲波協同酶的作用更易將細胞內物質釋放出來,提高了有效成分的得率,所以此類方法亦可應用于植物中其他化合物的提取,提高提取效果。

在本試驗中,當啤酒花總黃酮質量濃度為2.0 mg/mL時,對·OH和DPPH清除效果較好,分別為89.3%和94.3%,抗氧化性與維生素C接近。

在本試驗中只是提取工藝以及抗氧化活性初步研究[11],啤酒花的其他部位包括葉及其枝蔓有效成分的活性有待開發和研究。隨著醫學的不斷創新和發展,學者們對啤酒花的研究也越來越深入[14],其良好的藥理功能也逐漸被人們了解。我們將進一步探究將啤酒花黃酮加入油脂后的抗氧化功效,試圖將其應用為一種新型的天然油脂抗氧化劑,為啤酒花黃酮類化合物的開發利用提供了理論依據,預示著黃酮類化合物必將成為啤酒花領域的研究熱點。

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