新疆阿拉爾市綿羊產單核細胞李氏桿菌帶菌情況的調查

吳 靜,陳 瑛,賈桂珍

(塔里木大學動物科學學院,新疆 阿拉爾 843300)

產單核細胞李氏桿菌(Listeria mohocytogehes,L.mohocytogehes)是一種重要的人獸共患病病原菌,自1926年Murray等[1]從家兔體內首次分離到本病原以來,它已呈世界性分布,在包括人類在內的40多種哺乳動物、20多種飛禽類和部分水生動物均可分離到該菌。國內有關動物李氏桿菌病例的報道很多,波及全國10個省市,涉及動物有綿羊、山羊、牛、豬、雞、兔、鴨、鵝、鹿、鸚鵡、北極狐等,平均死亡率達32%以上,對畜牧業造成了較大的危害。在動物中綿羊對產單核細胞李氏桿菌的易感性最高,其感染多與青貯飼料相關[2]。目前,WHO已將產單核細胞李氏桿菌定為20世紀90年代四大食源性疾病致病菌[3]。中國預防醫學科學院流行病學微生物研究所徐建國博士也將其列為21世紀對中國人衛生健康具有重大影響的12種病原微生物之一[4],對人類健康造成極大威脅。

本試驗以阿拉爾周邊綿羊為研究對象,無菌采集綿羊的鼻液,通過傳統細菌分離鑒定技術,進行產單核細胞李氏桿菌的分離鑒定,收集產單核細胞李氏桿菌的資源;并對鑒定菌株通過小鼠實驗測得單核細胞李氏桿菌的致病性。調查結果為該地區動物性食品安全評估及李氏桿菌的監測提供參考和科學數據。對于李氏桿菌病的預防、診斷和治療新疆地區李氏桿菌病提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗對象 阿拉爾周邊綿羊。

1.1.2 試劑和培養基 0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)、PALCAM 瓊脂、LB肉湯,均購自杭州天和微生物試劑有限公司;血瓊脂平板、糖發酵試驗培養基;木糖、七葉苷由塔里木大學動物科學學院微生物生物實驗室提供;1%鹽酸吖啶黃、1%萘啶酮酸鈉鹽、PALCAM選擇性添加劑,購自杭州天和微生物試劑有限公司;甲基紅、V-P試驗培養基自制;甲基紅指示劑、V-P試驗指示劑、革蘭染液由塔里木大學動物科學學院微生物生物實驗室提供。

1.1.3 試驗動物 體重18～20 g小鼠10只由塔里木大學動物科學學院實驗站提供。

1.1.4 主要儀器 立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械廠,型號:LDZX-50KB);數顯不銹鋼電熱培養箱(上海博迅實業有限公司生產,型號:HPX-9272MBE);潔凈工作臺(上海博迅實業有限公司生產,型號:SW-CJ-ZF);電子顯微鏡(萊卡制造)、電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司,型號:DK-S26);冰箱、電子天平、搖床、三角瓶、無菌平皿、試管、1 mL無菌注射器等。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集及預處理 以無菌操作用滅菌棉簽在綿羊鼻腔中刮取分泌物,共采集樣品120份,其中9團采集60份,10團采集60份。

1.2.2 增菌 參照國標GB/T4789.30-2010法將采集的120份樣品,分別放入5 mL LB 1增菌液中,恒溫培養箱培養(30℃ ±1℃,24 h),然后用移液槍移取0.1 mL,轉種于10 mL LB 2增菌液內,放入搖床30℃ ±1℃培養18 h～24 h。

1.2.3 劃線分離培養 采用三區劃線法將LB 2增菌液劃線接種于PALCAM瓊脂平板,放入恒溫培養箱36℃ ±1℃培養24 h～48 h,觀察各個平板上生長的菌落。

1.2.4 革蘭染色 挑取典型菌落涂片,革蘭染色鏡檢。根據菌體形態及染色特性初步判定,并將其進一步純化培養。通過鏡檢挑取形態特征和排列與產單核細胞李氏桿菌相似的菌落劃線接種與0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)斜面,于恒溫培養箱30℃ ±1℃培養24 h～48 h,即為純培養。

1.2.5 生化鑒定 將純培養物分別接種于M.R.、V-P、木糖、鼠李糖、甘露醇、七葉苷、葡萄糖、麥芽糖等培養基中,于36℃ ±1℃培養18～24 h。

1.2.6 小鼠毒力試驗 從已鑒定為產單核細胞李氏桿菌分離菌株試管斜面上挑取1接種環的細菌接種于含5 mL LB的試管中,置37℃培養箱中培養24 h后,取0.1 mL接種0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)斜面上培養8 h～12 h后,用L棒刮下菌苔,用5 mL滅菌的生理鹽水稀釋與標準麥氏比濁管比濁。并根據比濁管所含的細菌濃度換算出所需的菌懸液濃度,即每毫升含1.0×1010CFU/mL的菌懸液,所得出的就是測試菌液。取此菌懸液進行小鼠腹腔注射,每株菌注射2只,每只注射0.5 mL,觀察小鼠發病及死亡情況,并設置對照組,對照組小鼠注射0.5 mL滅菌生理鹽水。

2 試驗結果

2.1 分離培養結果 在120份樣品中有11份樣品在PALCAM瓊脂培養基長出了疑似產單核細胞李氏桿菌的特征性菌落,菌落為圓形灰綠色,大小2～3 mm,有些菌落有黑色凹陷。

2.2 革蘭氏染色結果 對11份樣品中的典型菌落進行革蘭染色,染色鏡檢顯示,有9份樣品中染色結果符合產單核細胞李氏桿菌,產單核細胞李氏桿菌為革蘭陽性短小桿菌,大小為 0.4～0.5 μm ×0.5～2 μm,兩端鈍圓,呈“V”字形或“ Y”字形,單在排列。通過分離培養和染色鏡檢,得到9株疑似產單核細胞李氏桿菌的純培養物。

2.3 生化鑒定結果 9株菌的生化鑒定結果見表1。

表1 產單核細胞李氏桿菌的生化鑒定

通過生化鑒定,9株菌中有4株菌符合產單核細胞李氏桿菌,分別是1,2,5號和8號菌株;產單核細胞李氏桿菌M.R.、V-P試驗陽性,能發酵麥芽糖、葡萄糖、鼠李糖和七葉苷,不發酵甘露醇和木糖。

2.4 小鼠毒力試驗結果 小鼠接種1號、2號、5號、8號產單核細胞李氏桿菌6～8 h后表現食欲不振,精神委靡,被毛雜亂,運動遲緩,呼吸困難。其中1號、2號表現為身體向一側傾斜,后腿拖拉,共濟失調,最后死亡。剖檢死亡的小鼠可見胸腔積液,肺臟腫大、邊緣鈍圓,有出血斑,肝臟腫大,呈紫紅色。

3 討論

產單核細胞李氏桿菌病是由產單核細胞李氏桿菌引起的一種人獸共患病,其中羊最為敏感。產單核細胞李氏桿菌作為一種重要的病原菌,廣泛存在于自然界,由于產單核細胞李氏桿菌對各種惡劣環境條件有著較強的耐受性,使得其較易處于食物鏈的每一個環節而導致人和動物發病,使得各種食品受到污染,最終嚴重威脅人類的健康[5]。本試驗通過傳統的細菌分離鑒定技術從阿拉爾市周邊規模化養羊場采集的樣本中分離出4株產單核細胞李氏桿菌,且4株產單核細胞李氏桿菌對小鼠均有致病性,可見產單核細胞李氏桿菌為阿拉爾市規模化養羊場的主要病原菌之一。通過阿拉爾市周邊規模化養羊場產單核細胞李氏桿菌帶菌情況的調查,為阿拉爾市規模化養羊場羊病防治提供理論依據。

從新疆阿拉爾周邊樣品的產單核細胞李氏桿菌調查結果來看,120份樣品中有4份樣品為陽性,陽性率為3.3%,與王一明等調查的結果基本相似,陽性率為4.0%[6]。此調查采集都是新鮮樣品,在生產線上第一時間采集,樣品受環境污染機率較小,可以真實反映羊群的帶菌情況,但是還需對分離鑒定菌株進行分子水平的毒力基因檢測等。

產單核細胞李氏桿菌作為一種重要的食源性人獸共患性病原在過去的幾十年一直受到高度重視,相信隨著對單核細胞李氏桿菌的深人研究,我們會更加深人和全面地了解病原菌的致病機制,為更好地控制重大疾病提供依據。

4 結論

從阿拉爾市無菌操作采集羊鼻拭檢樣120份,其中4份樣品中分離并鑒定為產單核細胞李氏桿菌,帶菌率達3.3%。

對鑒定的4株進行小鼠的致病性試驗,分離鑒定的4株產單核細胞李氏桿菌均引起小鼠發病,其中2株菌可使小鼠在感染后72 h內死亡。調查結果為該地區動物性食品安全評估及產單核細胞李氏桿菌的監測提供參考和科學依據。

參考文獻:

[1] Murray E G D,Webb R A,Swann M B R.A disease of rabbits characterized by a large mononuclear leucocytosos,caused by a hitherto undescribed bacillus bacterium monocytogenes[J].J Pathol bacterial,1926,29:407-439.

[2] 楊霞,剡根強,王靜梅,等.新疆部分地區綿羊及青貯飼草中單核細胞增多性李氏桿菌的調查[J].中國獸醫雜志,2004,40(8):19-20.

[3] Membre J M,Kubaczka M,Dubois J,et al.Temperature effect on Listeria monocytogenes Growth in the event of Contamination of Cooked Pork Products[J].Food Prot,2004,67(3):463-469.

[4] 十二種病原微生物可能影響中國人的健康.www.biologic.cn2088.com,2002,04:05.

[5] 馬光強,劉麗娟,文明,等.山羊源產單核細胞李斯特菌的分離與鑒定[J].動物醫學進展,2016,37(3):33-38.

[6] 王一明,張海蘭,李靜,等.新疆部分地區綿羊及其環境中單核細胞增多性李氏桿菌分布狀況的調查[J].家畜生態學報,2008,29(3):90-92.