河南省42株奶牛臨床型乳房炎病原菌的分子鑒定及藥敏試驗

皇甫和平,潘昊純,石冬梅,王 軍,宋予震,許文博,史靜柯,李聰聰,王林康

(河南牧業經濟學院動物醫學院,河南 鄭州 450046)

奶牛乳房炎是由于病原菌侵入奶牛的乳腺組織,引起奶牛的乳房發生炎癥。該病在個體養殖戶、小型和大型奶牛養殖場均經常發生,病牛的乳品質和產奶量均降低,這不僅阻礙乳品經濟產業的發展,還影響人類社會公共衛生事業以及食品安全,抑制著奶牛養殖業的發展。目前,對于奶牛乳房炎的防治主要使用抗生素,但長期使用抗生素,會使病原菌產生不同程度的耐藥性。據流行病學調查報告顯示,引起奶牛乳房炎的病原菌有150余種[1],但臨床上較常見的有20多種,其中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌是主要病原菌,三者可占到90%之多[2],不同的地區不同的細菌所占的比例有一定的差異。因此及時掌握各自地區奶牛乳房炎病原菌的種類和耐藥情況是非常重要的,不僅可以提高奶牛生產性能、減少經濟損失,還對促進本省部分地區奶業持續健康發展具有極其重要的意義。

傳統的細菌分離鑒定過程不僅繁瑣復雜,而且耗時,16S rRNA基因序列分析可以實現對病原菌進行快速、準確地分類和鑒定[3]。課題組從鄭州、焦作的3家奶牛場采集臨床型乳房炎奶樣并進行病原菌的分離培養,對16S rRNA基因進行了PCR擴增,通過藥敏試驗進行耐藥性分析,為臨床合理用藥和改善乳房炎預防措施提供參考。

1 材料

1.1 培養基與試劑 營養肉湯,購自廣東環凱微生物科技有限公司;鮮血瓊脂平板、DL-2 000 DNA Marker,購自寶生物工程(大連)有限公司、4S Green核酸染料,購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 儀器 900系列超低溫冰箱由美國賽默飛世爾科技有限公司生產;ETC-811 PCR儀由北京東勝創新生物科技有限公司生產;Universal HoodⅡ凝膠成像系統由美國伯樂(BIO-RAD)公司生產。

1.3 藥敏紙片 紅霉素(E15)、頭孢噻肟(CTX30)、環丙沙星(CIP5)、克林霉素(DA2)、慶大霉素(CN10)、左氧氟沙星(LEV5)、萬古霉素(VA30)、四環素(TE30)、壯觀霉素(SH100)、頭孢曲松(CRO30)、氨芐西林(AMP10)、阿齊紅霉素(AZM15)、阿米卡星(AK30)、氧氟沙星(OFX5)、復方新諾明(SXT25)、妥布霉素(TOB10)、氯霉素(C30),藥敏片由英國OXOID公司生產。

1.4 引物 參考Weisburg[4]的方法合成16S rRNA基因通用引物,引物序列為:16S-F(5′-CCG AAT TCG TCG ACA ACA GAG TTT GAT CATGGCTCAG-3′)、16S-R(5′-CCC GGGATCCAAGCT TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)。

2 方法

2.1 奶樣采集 選擇鄭州的2家及焦作的1家奶牛場進行采樣,共計采集臨床型乳房炎病乳47份,奶樣采集后2 h內送去實驗室進行微生物的培養,或凍存于-80℃冰箱備用。

2.2 細菌的分離與培養 將奶樣搖勻,以無菌操作涂布于血平板,37℃恒溫箱中培養24 h,挑選可疑的典型菌落涂片、革蘭染色、鏡檢。然后將典型菌落再次接種于鮮血瓊脂平板進行純化培養,18～24 h后鏡檢,如果細菌純凈則接種于營養肉湯,37℃,180 r/min震蕩培養18 h,用于細菌DNA的提取。

2.3 DNA提取 取1 mL細菌肉湯于1.5 mL離心管中,10 000 r/min離心5 min棄掉上清液,加入600 μL TE緩沖液,100℃沸水浴10 min,立即冰浴2 min,12 000 r/min離心10 min。上清液即為DNA溶液,-20℃備用或者立即使用。

2.4 16S rRNA PCR16S rRNA PCR反應體系(25 μL):10 × Ex Taq Buffer 2.5 μL,Ex Taq酶 0.125 μL,Mg2+2 μL,dNTP 2 μL,模板 DNA 1 μL,16S rRNA-F 1μL,16S rRNA-R 1μL,ddH2O 15.375 μL。反應條件:94℃預變性30 s;98℃變性10 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,30個循環;72℃延伸10 min。將PCR產物用1%瓊脂糖凝膠在1×TAE電泳液中電泳,用4S Green Nucle Acid染色,在凝膠成像系統中觀察PCR結果。

2.5 DNA測序鑒定 電泳檢測后的PCR產物,由上海生工生物工程技術服務有限公司測序,并將測序結果通過NCBI在線軟件BLAST進行比較分析。

2.6 藥敏試驗 選取17種藥敏紙片,根據美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)抗菌藥物敏感性試驗標準(M100-S23),通過抑菌圈的大小判定細菌對藥物的耐藥性與敏感情況[5]。

3 結果與分析

3.1 奶牛臨床型乳房炎病原菌的分離結果 47份臨床型奶牛乳房炎乳樣共分離出細菌47株,鑒定出42株,其中鄭州的2家奶牛場34株,焦作的1家奶牛場8株。根據細菌的分離培養,菌落形態,革蘭染色鏡檢等特性,可初步判定分離細菌中主要有革蘭陰性桿菌18株、革蘭陽性桿菌14株、球菌9株、真菌1株等。

3.2 16S rRNA基因PCR結果 對分離的47株菌提取基因組DNA,擴增16S rRNA基因,結果如圖1,擴增得到約1 600 bp的目的條帶。

圖1 部分樣品16S rRNA擴增結果

3.3 16S rRNA方法測序分析 在NCBI上對所得的序列進行BLAST比對,結合傳統的微生物鑒定法,對鄭州、焦作地區的47份乳房炎奶樣,共分離得到17種42株細菌,由表1可知,本試驗檢出的42株細菌中,鄭州的2家奶牛場分離鑒定出14種34株菌,環境性病原菌12種28株,所占比例最多(82.4%),以大腸桿菌、克雷伯氏菌為主,分別占20.6%、17.6%;傳染性病原菌只有2株金黃色葡萄球菌,占5.9%。焦作的1家奶牛場分離鑒定的病原菌只有4種8株,環境性病原微生物4株,占50.0%,未分離鑒定出傳染性病原微生物。鄭州和焦作3家奶牛場的環境性病原菌分離率高,說明兩市的3家奶牛臨床型乳房炎與環境性病原菌密切相關,應加強環境衛生管理,給奶牛提供一個舒適的環境。鄭州的2家奶牛場分離得到的傳染性病原菌比例、環境性病原菌比例均高于焦作,鄭州的2家奶牛場更應該關注環境衛生的改善。焦作臨床型乳房炎奶樣沒有分離鑒定出傳染性病原菌,可能該市的1家奶牛場對致病菌采取了較好的防治措施。

表1 分離菌株種類

3.4 藥敏試驗結果 分離菌株中的26株致病菌的耐藥結果如表2,鄭州的2家奶牛場的23株致病菌對11類藥物均產生不同程度的耐藥,耐藥率4.35%～56.52%,對喹諾酮類、頭孢類、復方新諾明、氨芐西林、四環素、氯霉素、紅霉素的耐藥率為8.70%～56.52%,對氨芐西林的耐藥率最高,高達56.52%。焦作的1家奶牛場的3株致病菌只對復方新諾明、氨芐西林、四環素、氯霉素4種抗生素產生耐藥性,耐藥率33.33%～100%,對其余7類藥物敏感。鄭州和焦作兩市的3家奶牛場致病菌對復方新諾明、氨芐西林、四環素、氯霉素這4種藥物產生嚴重的耐藥性,耐藥率33.33%～100%。鄭州奶牛場耐藥情況比焦作奶牛場耐藥情況嚴重。

26株致病菌的多重耐藥結果如表3,分離的菌株產生了較為嚴重的多重耐藥,26株致病菌有15株產生了多重耐藥,占57.69%。其中,最嚴重的是1株大腸桿菌耐11種抗生素(3.85%),耐6種抗生素的菌有2株(7.69%),耐5種抗生素的菌有5株(19.23%),耐4種抗生素的菌有5株(19.23%),耐3種抗生素的菌有2株(7.69%)。

4 討論

本次研究共計分離鑒定出17種42株細菌,說明河南省鄭州、焦作兩市的3家奶牛場臨床型乳房炎的病原菌種類繁多,尤其是鄭州的2家奶牛場,環境性致病菌數量均多于焦作,提醒相應奶牛場注意改善奶牛生活環境,加強管理。在分離的病原菌中,大腸桿菌,是環境性致病菌;克雷伯氏菌、表皮葡萄球菌、粘質沙雷菌是條件致病菌,對人有較強的致病性;糞腸球菌不僅可以誘發心內膜炎,還可以感染尿路和傷口;金黃色葡萄球菌可以引起人和動物的局部化膿性感染,其與蠟樣芽孢桿菌均可以引起人類食物中毒;除此之外,還檢測出普通變形桿菌、豬葡萄球菌、模仿葡萄球菌、氣單胞菌,這些菌株均具有致病性。

表2 分離菌株的耐藥結果

表3 26株菌的多重耐藥率

目前,對于奶牛乳房炎的防治還是以使用抗生素為主,但大量使用抗生素,會使牛乳中殘留的抗生素超標,人類長期食用含抗生素的乳品,會危害人類的身體健康。分離菌株中的26株致病菌的耐藥結果如表2,鄭州2家奶牛場分離出的23株致病菌對11類藥物均產生不同程度的耐藥,耐藥率4.35%～56.52%。焦作1家奶牛場分離出的3株致病菌只對復方新諾明、氨芐西林、四環素、氯霉素4種藥物產生耐藥性,耐藥率33.33%～100%,對其余7類藥物敏感。鄭州的2家奶牛場耐藥情況比焦作嚴重,這可能與牛場在發生乳房炎后長期固定使用這幾種抗生素有關。一株病原菌同時對3種及3種以上的藥物產生耐藥為多重耐藥。26株致病菌有15株產生多重耐藥,多重耐藥結果如表3,占57.69%。其中,最嚴重的是1株大腸桿菌耐11種抗生素(3.85%)。因此,建議該牛場定期對臨床型乳房炎奶樣進行細菌的分離鑒定、耐藥性分析及合理交替使用抗生素,以便更好地防治乳房炎。本次試驗分離的金黃色葡萄球菌數量少的原因可能是前期的藥物治療造成的,也可能是該牛場的金黃色葡萄球菌本來就少。

本次試驗將傳統的微生物分離鑒定方法和16SrRNA分子生物學鑒定方法結合起來,分析奶牛乳房炎中主要致病菌的種類,不僅大大縮短了確定病原菌的時間,還能夠及時防治奶牛的乳房炎病癥,為快速鑒定乳房炎致病菌提供有效方法和科學依據。

參考文獻:

[1] 徐丹丹,楊彬,王建發,等.圍產期奶牛乳房炎與E2、P4免疫調節作用及TLRs、NLRs介導天然免疫三者間的關系[J].中國獸醫學報,2016,36(8):1 455～1 463.

[2] 周長卿,王珂,胡俊杰,等.青海地區奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌的基因型分析[J].動物醫學進展,2014,35(2):11～16.

[3] 楊霞,陳陸,王川慶.16SrRNA基因序列分析技術在細菌分類中應用的研究進展[J].西北農林科技大學學報,2008,36(2):55～60.

[4] Weisburg W G,Barns S M,Pelletier D A,et al.16S ribosomal DNAamplification for phylogenetic study[J].J Bacteriol,1991,173(2):697～703.

[5] 皇甫和平,許文博,石冬梅,等.奶牛蜂窩織炎奇異變行桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國獸醫雜志,2016,52(10):32～34.

[6] 甘露,李姝,徐君,等.奶牛乳房炎病原菌的分離和PCR方法快速鑒定[J].安徽師范大學學報,2012,35(4):344～350.