氨基多糖納米微粒對RAW264.7細胞分泌 TNF-α、IL-1β影響的試驗

趙義龍,黃金鳳,趙金香,矯繼峰

(1.新疆農業職業技術學院,新疆 昌吉 831100;2.昌吉市華牧動物診所,新疆 昌吉 831100;3.營口理工學院 ,遼寧 營口 115014)

氨基多糖(GAG)廣泛存在于動物體內,在自然界中產量非常豐富。GAG具有輔助免疫、抗菌、抗病毒等生物學活性。納米材料是顆粒直徑在1～100 nm范圍內且具有表面效應、小尺寸效應及量子尺寸效應等特殊效應的一類材料。氨基多糖納米微粒(Chitosan nanoparticle,CNP),是氨基多糖結合納米科技研制的新型多糖納米粒子。該納米微粒據推測除應具有輔助免疫、抗菌等特性外應兼具納

巨噬細胞是免疫效應細胞,具有多種免疫功能,包括免疫防御、免疫監視、免疫調節等,在機體的先天性免疫系統中發揮重要作用[1-2]。TNF-α、IL-1β是活化的巨噬細胞殺滅病原微生物、提高機體免疫力的主要細胞分子[3-4],因此本試驗選擇鼠源巨噬細胞株RAW264.7來探討CNP對分泌細胞因子TNF-α、IL-1β的影響,揭示CNP促進免疫功能的作用機理,為氨基多糖在動物微生態制劑開發及綜合利用方面提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 氨基多糖納米微粒為浙江大學飼料科學研究所動物分子營養教育部重點實驗室制備。TNF-α ELISA檢測試劑盒,購自武漢博士德生物技術有限公司;IL-1βELISA檢測試劑盒,購自武漢博士德生物技術有限公司;DMEM高糖培養液、胎牛血清、PBS、Hank′s,購自杭州四季青生物工程材料有限公司;胰酶、DMSO,購自美國Sigma公司;RAW264.7細胞,購自中國科學院上海生化細胞所干細胞庫。

1.2 試驗儀器 納米粒度及Zeta電位分析儀(Zetasizer Nano-ZS90,Malvern Instruments);超凈工作臺(HERA),購自HermLe公司;CO2培養箱,購自SANYO公司;倒置顯微鏡,購自Olympus公司;多功能酶標儀(MRX),購自美國Dynex技術公司。

1.3 試驗分組 將鼠源巨噬細胞RAW 264.7復蘇后,按常規細胞培養方法培養,待細胞對數生長期時用于實驗,用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液調整細胞濃度至1×107個/mL,將每塊6孔板的3孔作為試驗組、3孔作為對照組,做3次重復試驗。每孔加入細胞懸液2 mL,置于5%CO2,37℃培養箱中孵育6 h,傾去培養液后,每孔加入2 mL含10%胎牛血清的無酚紅DMEM高糖培養液,試驗組加入CNP(終濃度為0.3 mg/mL)0.2 mL,對照組則為DMEM完全培養液。因前期在裸鼠試驗中采用終濃度為0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL、0.7 mg/mL進行用藥測試,結果終濃度為0.3 mg/mL的用藥效果最好,故本試驗選取其作為最佳終濃度。將細胞置于5%CO2、37℃培養12 h、18 h及24 h后收集細胞上清液,運用酶聯免疫法測定CNP對細胞因子TNF-ɑ、IL-1β 的影響[5-6]。

1.4 數據分析 用統計軟件SPSS 19.0進行統計分析。試驗數據以表示。組間數據比較采用單因素方差分析,P<0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 各時間段CNP對TNF-ɑ的影響 通過試驗發現,CNP試驗組(CNP劑量為0.2 mL)不同時間段對巨噬細胞RAW264.7作用后其差異均存在統計學意義,具體如表1。

表1 各時間段CNP作用RAW264.7產生TNF-α的影響

由表1可知氨基多糖納米微粒(CNP)12 h加藥組與除24 h對照組外的各組均除差異顯著;18 h加藥組與其他各組均差異顯著;24 h加藥組與其他各組均差異顯著。因此說明CNP對巨噬細胞分泌TNF-ɑ具有明顯的促進作用。

2.2 各時間段CNP對IL-1β的影響 通過試驗發現,CNP試驗組(CNP劑量為0.2 mL)不同時間段對巨噬細胞RAW264.7作用后其差異均存在統計學意義,具體如表2。

表2 各時間段CNP作用RAW264.7產生IL-1β的影響

從表2可知,氨基多糖納米微粒(CNP)12 h加藥組與除18 h加藥組外其他各組均差異顯著;18 h加藥組與除12 h加藥組外其他各組均差異顯著;24 h加藥組與其他各組均差異顯著,因此說明CNP對巨噬細胞分泌IL-1β具有一定的促進作用。

3 討論

3.1 氨基多糖被認為是迄今為止自然界惟一的一種帶陽離子的天然多糖,在自然界中廣泛存在[7-9]。CNP是經納米處理的帶有氨基的高分子材料,通過本實驗可以證明CNP能促進巨噬細胞分泌TNF-α、IL-1β等細胞因子,對機體免疫系統有激活和促進作用,其具有輔助免疫的特性。

3.2 RAW264.7巨噬細胞株是BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞經過白血病病毒誘生后產生的具有無限繁殖能力的細胞系,具有與腹腔細胞相同的功能和特點,可以替代腹腔巨噬細胞并且避免了原代細胞不能無限繁殖的缺點[10-12]。本試驗選取RAW264.7為巨噬細胞模型,即模擬體內環境,又避免了原代細胞的缺陷,為本實驗的順利進行提供基礎條件。

3.3 CNP可能通過多條信號轉導途徑調節免疫細胞的功能和代謝,此為氨基多糖發揮免疫調節作用的重要機制,其中氨基多糖激活巨噬細胞從而調節免疫功能是較為重要的途徑[13]。CNP可以識別并結合巨噬細胞表面多種模式識別受體,經各種信號傳導通路將信號傳入細胞內,引起細胞內一系列的信號級聯反應,從而調控相關基因表達,分泌多種免疫活性物質而發揮免疫調節作用[14]。

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