牛卵形巴貝斯蟲不同靶基因PCR檢測方法的比較

田萬年,李榮權,薛書江,賈立軍,張守發

(1.吉林農業科技學院動物科技學院,吉林 吉林 132101;2.延邊大學農學院,吉林 延吉 133002)

牛的卵形巴貝斯蟲病(Babesia ovata)是由巴貝斯科巴貝斯屬的卵形巴貝斯蟲寄生于牛紅細胞內所引起的寄生蟲病。我國于1986年在河南省盧氏縣牛體內發現該病,隨后1994年,在甘肅張家川回族自治縣牛體內分離到卵形巴貝斯蟲[1]。目前牛卵形巴貝斯蟲病的診斷主要通過血液涂片,顯微鏡檢查為主,隱性感染牛的血液染蟲率較低,顯微鏡檢測易出現漏檢和誤診。PCR方法是一種快速、敏感、特異的診斷方法,已應用牛卵形巴貝斯蟲病的診斷[2-3]。目前對該病不同靶基因進行PCR方法的比較研究尚未見相關報道。因此,本試驗根據GenBank已公布的卵形巴貝斯蟲AMA-1、CCTη和18S rRNA基因序列分別設計3對引物,從特異性、敏感性和臨床樣本檢出率方面進行對比,為牛卵形巴貝斯蟲病的早期診斷及流行病學調查提供快速、敏感的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 血液樣本采自吉林省琿春地區散養的延邊黃牛60份,無菌采取抗凝血,用PBS洗3次。存于-20℃備用。同時制作了血液涂片,甲醛固定保存,供染色鏡檢。牛巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲標準基因組DNA由日本帶廣畜產大學玄學南教授惠贈。瑟氏泰勒蟲基因組DNA由延邊大學預防獸醫實驗室保存。

1.2 主要試劑 全血DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DL-2 000 DNA Marker等,均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物的設計與合成 根據GenBank上登錄的牛卵形巴貝斯蟲18S rRNA基因序列(AY081192)、AMA-1基因序列(AB634843)和CCTη基因序列(AB367928),利用Primer Premier 5.0軟件設計了3對特異引物(見表1)。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表1 試驗所用引物信息

1.4 牛卵形巴貝斯蟲DNA標準模板的制備 按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA,抽提的DNA用50 μL TE溶解,-20℃保存備用。

1.5 PCR反應條件 以提取的牛卵形巴貝斯蟲DNA為模板,以18S rRNA為靶基因PCR反應條件:94℃預變性5 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,30個循環,最后72℃延伸7 min;以AMA-1為靶基因PCR反應條件:94℃預變性5 min,94℃變性20 s,58℃退火45 s,72℃延伸30 s,30個循環,最后72℃延伸7 min;以CCTη為靶基因PCR反應條件:94℃預變性5 min,94℃變性20 s,60℃退火30 s,72℃延伸45 s,30個循環,最后72℃延伸7 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 特異性試驗 以卵形巴貝斯蟲基因組DNA為試驗樣本,以牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲基因組DNA為對照樣本。分別應用3對引物進行PCR擴增,分析其特異性。

1.7 敏感性試驗 用紫外分光光度計測定已提取的卵形巴貝斯蟲DNA的D260nm值,計算DNA含量。以10倍為梯度進行稀釋成7個不同濃度,進行PCR擴增,對比其敏感性。

1.8 臨床樣本的檢測試驗 應用3對引物對采自吉林省琿春地區的60份血液樣品進行PCR檢測。比較3種靶基因PCR方法的陽性檢出率。同時,與血液涂片鏡檢相對比。

2 結果

2.1 基因組DNA濃度 將提取的牛卵形巴貝斯蟲基因組DNA經紫外分光光度儀測定其D260nm值,DNA 含量為16 ng/μL。

2.2 特異性試驗 將以牛卵形巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲基因組DNA為模板,分別用3對引物進行PCR擴增,PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。電泳結果顯示,僅牛卵形巴貝斯蟲DNA樣本擴增后出現特異性DNA條帶,而牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲均無此擴增條帶出現(見圖1)。

圖1 特異性試驗結果

2.3 敏感性試驗 取提取的牛卵形巴貝斯蟲DNA按10倍倍比稀釋后,分別用不同靶基因引物進行PCR擴增,反應結果進行瓊脂糖凝膠電泳檢測(見圖2)。以18S rRNA靶基因的PCR敏感性最高,最小檢測 DNA含量為16 fg/μL;以 CCTη靶基因的PCR敏感性最低,最小檢測DNA含量為1.6 pg/μL;而以AMA-1靶基因的PCR敏感性最高,最小檢測DNA含量為1.6 fg/μL。

圖2 敏感性試驗結果

2.4 臨床樣本檢測 對采自吉林省琿春地區60份血液樣本分別用3對引物進行PCR擴增。以18S rRNA基因設計引物的陽性率為30%(18/60),以AMA-1基因設計引物的陽性率為25%(15/60),以CCTη基因設計引物的陽性率為21.67%(13/60),且血液涂片鏡檢診斷為陽性的樣本經PCR診斷均為陽性。

表2 臨床樣本檢測結果

3 討論

牛卵形巴貝斯蟲病主要表現為高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿,對牛危害較大,嚴重制約養牛業發展。因此,對該病進行早期準確診斷是有效控制其蔓延的重要手段。目前,在所建立的牛卵形巴貝斯蟲病的診斷方法中,PCR方法具有特異性強、敏感性高的優點是目前該病臨床診斷和流行病學調查的主要方法[4-5]。不同基因其開放閱讀框的穩定性不同,其敏感性、特異性會受到影響[6]。因此篩選出牛卵形巴貝斯蟲病特異、敏感的PCR診斷方法是十分必要的。

18S rRNA為核糖體小亞基的DNA序列,該基因在不同蟲種間變異較大,在同種間具有較好的保守性,已廣泛應用于病原的分類、鑒定的靶序列[7-8]。頂膜抗原1(AMA-1)最早在諾氏瘧原蟲中被鑒定出來,在瘧原蟲侵染宿主細胞中被認為是不可或缺的抗原蛋白,AMA-1是蟲體入侵紅細胞之前以膜結合形式分泌到蟲體表面蛋白[9]。含t-復合多肽1(TCP-1)的伴侶素(Chaperonin)簡稱為CCT,CCT又稱Tric(TCP-1 ring complex)分子伴侶系統屬于分子伴侶素家族,CCTη是CCT的一個亞基,存在于細胞漿中異型寡聚蛋白[10]。黃國明等[1]對牛卵形巴貝斯蟲伴侶素CCTη基因進行了克隆與生物信息學分析。本試驗根據Gen-Bank上登錄的牛卵形巴貝斯蟲18S rRNA、AMA-1和CCTη基因序列設計3對引物,分別進行PCR擴增,從特異性、敏感性和臨床樣本檢出率方面比較。結果表明,18S rRNA的PCR方法敏感性最高,比AMA-1基因敏感10倍,比CCTη基因敏感100倍。臨床樣本檢測表明,以18S rRNA為靶基因設計引物PCR檢出率最高,陽性率為30%(18/60)。本試驗通過對卵形巴貝斯蟲不同靶基因的PCR檢測比較,篩選出以18S rRNA基因PCR方法的敏感性和臨床樣本檢出率最高,為牛卵形巴貝斯蟲病的早期診斷和流行病學調查提供了有效方法。

參考文獻:

[1] 巴音查汗,五十嵐郁男.牛卵形巴貝斯蟲的體外培養[J].中國獸醫寄生蟲病,2001,9(2):15-17.

[2] Sivakumart,Tagawa M,Yoshinari T,et al.PCR detection of Babesia ovata from cattle reared in Japan and clinical significance of infection withTheileria orientalis[J].J Clin Microbiol,2012,50(6):2 111-2 113.

[3] 黃國明,賈立軍,薛書江,等.牛卵形巴貝斯蟲巢式PCR診斷方法的建立及初步應用[J].中國獸醫學報,2012,32(10):1 484-1 487.

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[7] 龔真莉,劉光遠.馬屬動物梨形蟲病的PCR鑒別診斷方法研究[J].中國動物檢疫,2014,31(5):74-77.

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[9] 范麗哲.東方巴貝斯蟲3個免疫相關基因的克隆表達[D].武漢:華中農業大學,2014.

[10] 常曉燕,陳杰.伴侶素CCT的結構及與肌動蛋白、微管蛋白的作用機制[J].國外醫學生理、病理科學與臨床分冊,2003,23(6):596-598.