白羽鵪鶉IFN-γ基因克隆、序列分析及原核表達

劉梓欣,趙宏敬,王 雨,陶 金,邢明偉

(東北林業大學野生動物資源學院,黑龍江 哈爾濱 150040)

干擾素是一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調節等功能的細胞因子,可以通過調節機體的某些細胞來間接發揮抗病毒生物學作用,抑制病毒生長,促進免疫細胞活性。IFN-γ屬于Ⅱ型干擾素,主要是由活化的T細胞、NK細胞、NKT細胞產生的糖蛋白[1]。IFN-γ誘導基因轉錄主要通過干擾素信號肽轉導的經典模式 JAK-STAT途徑[2-3]。IFN-γ對體液免疫和細胞介導的非特異免疫反應具有重要調控作用。白羽鵪鶉的肉和蛋中含有豐富的蛋白質,具有較高的營養價值和藥用價值,在我國更是有“動物人參”的美譽[4]。其中白羽鵪鶉是中國自主培育出的優良品種,養殖戶也大規模的發展起來,飼養量已占全世界的1/5,已經成為世界第一鵪鶉養殖大國[5]。隨著鵪鶉集約化養殖程度不斷提高,鵪鶉病毒性疾病的感染率也在逐年上升[6]。新城疫、支氣管炎、鵪鶉痘病是引起鵪鶉死亡的主要疾病[7]。對克隆到的白羽鵪鶉Ⅱ型IFN-γ基因進行生物信息學分析,旨在利用大腸桿菌建立高效表達白羽鵪鶉IFN-γ(coIFN-γ)的體外表達系統,為進一步研究鵪鶉IFN-γ干擾素蛋白在機體抗病毒分子機制的研究和抗病毒藥物的開發奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 白羽鵪鶉(體長約為15 cm,體重為300～350 g),由哈爾濱市郊區某鵪鶉養殖場提供。克隆載體 pMD19-T、表達載體 pET-32a(+)、DL-2 000 DNA Marker、DL-10 000 DNA Marker由 TaKa-Ra(大連)公司提供;PCR引物由博仕生物公司合成;DNA凝膠回收試劑盒、高純質粒小量制備試劑盒,由Omega公司提供。

1.3 白羽鵪鶉IFN-γ基因的引物設計和PCR擴增 參考 GenBank中火雞(AJ000725)、雉雞(AJ001289)、柳雷鳥(DQ473434)、原鴿(NM001282845)等已知的IFN-γ基因序列,在同源性較高的位置設計特異性引物:coIFN-1a P1:5′-ATGACTTGCCAGACTTACAACTTGT-3′;coIFN-2b P2:5′-TTAGCAACTGCATCTCCTCAGACAC-3′,以脾臟提取的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR體系(10 μL)為:10× PCR Buffer 1 μL,dNTP(2.5 mmol/L)0.8 μL,cDNA 1 μL,引物 coIFN-1a 0.5 μL,引物 coIFN-2b 0.5 μL,rTaq 酶(5 U/μL)0.1 μL,補水至 10 μL。

采用熱啟動方法進行PCR,反應條件設為94℃預變性5 min,94℃變性40 s,53℃退火30 s,72℃延伸45 s,30個循環后以72℃最終延伸10 min。擴增結束,取擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,按照多功能DNA純化回收試劑盒說明書回收擴增后的目的片段。

1.4 陽性重組質粒pMD19-T-coIFN-γ的鑒定 取膠回收產物4 μL、pMD19-T克隆載體1 μL和 Solution I 5 μL混勻,16℃連接 5 h;取感受態細胞DH5α,冰浴中融化;將 10 μL pMD19-T-coIFN-γ 的連接產物加入含有100 μL感受態細胞的EP管中,混勻;冰浴30 min,42℃水浴熱激90 s,快速冰浴3～5 min。將200 μL LB培養基(不加抗生素)加入到EP管中,37℃,180 r/min,溫育1 h。最后將EP管中的液體轉移到Amp/LB平板上,37℃培養12 h;挑取白色單克隆菌落于5 mL Amp/LB液體培養基中,180 r/min(37℃)震蕩培養過夜,對菌液進行PCR鑒定。

選擇經鑒定為陽性的菌液提取質粒,取5 μL提取質粒用限制性內切酶EcoR I和Hind III各0.5 μL以及10×M Buffer 1 μL,ddH2O 補至10 μL于37℃水浴鍋中雙酶切2 h,然后取5 μL酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,選取結果為陽性的質粒pMD19-T-coIFN-γ送至哈爾濱博仕生物技術有限公司進行測序。

1.5 白羽鵪鶉IFN-γ基因的序列分析 利用DNA Star-MegAlign對coIFN-γ基因的開放閱讀框序列進行同源性分析。用Clustal X和MEGA 4.0軟件進行進化樹的構建分析;利用DNAMAN對鵪鶉、原雞(FJ788637)、原鴿(NM001282845)、灰雁(AY524421)、紅腿叫鶴(XM009701660)等的IFN-γ氨基酸序列進行相似性比對分析;利用在線軟件SWISS-MODEL對coIFN-γ進行3D結構模擬預測;利用在線軟件SignalP對coIFN-γ的氨基酸序列進行信號肽預測;利用在線軟件NetO Glyc-3.1對coIFN-γ的氨基酸序列進行糖基化位點分析。

1.6 白羽鵪鶉原核表達質粒 pET32a(+)-IFN-γ的構建根據測序結果設計引物P3:5′-CCGGAATTCCATACTGCAAGTAGTCTAAATC-3′(劃線部分酶切位點是EcoR I);P4:5′-CCGCTCGAGTTAGCAACTGCATCTCCT-3′(劃線部分酶切位點是Xhol I),在上、下游引物5′端分別引入EcoR I和Xhol I酶切位點,以重組質粒pMD19-T-coIFN-γ為模板,以P3、P4為引物擴增白羽鵪鶉成熟肽基因。分別以EcoR I和Xhol I雙酶切含 coIFN-γ成熟肽基因的 T載體和 pET32a(+)原核表達載體,切膠回收目的片后,在T4DNA連接酶的作用下,22℃連接10 min,轉化至DH5α感受態細胞。提取重組質粒,EcoR I和Xhol I雙酶切鑒定后,送至哈爾濱博仕生物技術有限公司測序,測序正確的重組質粒命名 pET32a(+)-coIFN-γ。

1.7 重組表達質粒pET32a(+)-coIFN-γ的誘導表達和鑒定 將pET32a(+)-coIFN-γ轉化至表達宿主菌BL21感受態細胞中,于37℃,加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG進行誘導表達。分別于誘導前、誘導后4 h收集菌液。同時設含表達載體pET32a(+)誘導后的 BL21陰性對照。取菌液1 mL,于室溫5 000 r/min離心5 min,收集菌體,重懸于50 mmol/L PBS(pH值為7.4)中,冰浴中超聲破碎(200 W ×10次,每次 3 s,間歇 3 s),最后于4℃、12 000 r/min離心10 min,收集上清和沉淀,于100℃加熱變性10 min,進行10%SDS-PAGE分析。

2 結果

2.1 白羽鵪鶉IFN-γ基因的PCR擴增結果 將得到的PCR的產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析后,出現一條約495 bp特異性條帶(圖1),與預期大小一致。

1.2.1 納入標準 ⑴所有入選患者均經MRI、X線檢查及術中關節鏡探查確診；⑵無其他軟組織損傷；③均伴有不同程度的膝后側酸脹、膝關節不適、行走或上下樓梯時膝關節局部交鎖、彈響等臨床表現。

圖1 PCR產物電泳結果

2.2 測序結果與白羽鵪鶉IFN-γ基因的序列分析測序結果表明,coIFN-γ基因的核苷酸序列為495 bp。

利用DNAMAN軟件對鵪鶉的γ干擾素氨基酸序列進行分析,成熟蛋白的理論分子量是18.90 kDa,等電點是9.17。經 http://www.cbs.dtu.dk/services/.網站提供的信號肽預測軟件分析,coIFN-γ氨基酸序列包含一個由24個氨基酸組成的信號肽序列和140個氨基酸組成的成熟肽序列,有2個糖基化位點(見封三彩版圖2,3)。

應用MEGA4.1生物軟件,對 coIFN-γ基因的ORF序列與GenBank數據庫中已有的其他禽類和一些常見水禽類動物的IFN-γ基因核苷酸序列進行同源性比較(見圖4)。分析結果顯示,coIFN-γ基因與日本鵪鶉同源性最高,能達到100%,與雞形目動物差異不明顯,同源性能達到95.6%。在系統進化樹中,白羽鵪鶉和日本鵪鶉在同一分支中,親緣關系較為接近,而與灰雁則較遠(圖5)。

圖4 鵪鶉IFN-γ基因核苷酸同源性比較

圖5 鵪鶉IFN-γ基因核苷酸系統發育樹

2.3 白羽鵪鶉重組表達質粒的鑒定 coIFN-γ成熟肽基因與pET32a(+)連接后,轉化至DH5α,挑取白色菌落提取重組質粒,經 EcoR I和;Xhol I單、雙酶切和PCR鑒定。1%瓊脂糖凝膠電泳顯示,雙酶切和PCR檢測的插入片段長約500 bp(圖6),與預期結果相符。將鑒定為陽性的重組質粒測序,測序結果與coIFN-γ成熟肽基因的編碼序列完全一致。證實成功地構建了重組原核表達質粒pET32a(+)-coIFN-γ。

圖6 鵪鶉IFN-γ重組表達載體的鑒定

2.4 重組白羽鵪鶉IFN-γ成熟肽基因的表達、鑒定在BL21中,重組表達質粒pET32a(+)-IFN-γ在IPTG誘導表達下,在30～40 kDa處可見特異蛋白質條帶,而以pET-32a(+)空載體對照,在相應位置沒有產生特異性條帶(圖7)。

圖7 鵪鶉IFN-γ蛋白的SDS-PAGE

3 討論

白羽鵪鶉是我國重要的經濟動物,具有一定的營養價值,養殖規模大,經濟價值高,隨著白羽鵪鶉規模化養殖的不斷發展,各種禽傳染性疾病的發生更為頻繁和嚴重,而且大量使用化學藥物會嚴重威脅禽肉等食品的安全,制約鵪鶉業的進一步發展。為此試驗開發新型抗病毒性生物制劑和免疫增強劑成為防治白羽鵪鶉重大疫病的重要途徑。IFN系統是機體對抗病毒感染的重要防疫系統,一般情況下,動物體內相關細胞的IFN基因處于靜止狀態,只有在病毒等因素的誘導下才能微量表達。同時,當IFN系統被激活后,血清IFN可以很快的散布到身體各器官處,細胞在接觸IFN的短時間內,就會產生抗病毒狀態,并且動物在1～3周內對病毒的重復感染都有抵抗作用。近年來,各國學者廣泛開展了禽類重組IFN抗病毒的研究。Plachy等[8]進行了雞重組IFN防治勞斯肉瘤病毒(RSV)腫瘤的研究;王玉東等[9-10]分別用雞 IFN-γ蛋白去抑制水泡性口炎病毒、新城疫的復制,證明了雞IFN-γ的抗病毒作用。李志中、曾巖等人的研究也表明雞IFN-γ與新城疫、禽流感滅活疫苗聯合作用也可以顯著提升免疫保護作用[11-12]。由于不同物種的IFN具有種屬特異性,許多在研究中應用的有效方法和成功經驗不能用于白羽鵪鶉IFN的研究[13]。

因為禽類的IFN-γ必須經過誘導因子刺激才能產生,本試驗從體外分離、經過刀豆素蛋白A刺激的鵪鶉外周血淋巴細胞中,應用TRIZol法提取鵪鶉總RNA,反轉錄得到鵪鶉的cDNA,用PCR擴增獲取IFN-γ基因,對核苷酸序列同源性及IFN-γ蛋白的理化性質、疏水性、保守區域結構進行分析,并對信號肽、糖基化位點、蛋白3D結構模擬預測。結果表明,coIFN-γ基因與日本鵪鶉同源性最高,能達到100%,與雞形目動物差異不明顯,同源性能達到95.6%,而與水禽差異性較大,coIFN-γ的同源性與動物分類地位是一致的,推測其IFN-γ生物學功能具有一定的種屬間特異性。對coIFN-γ的潛在糖基化位點進行預測,可為進一步研究coIFN-γ蛋白的真核表達載體選擇提供理論依據。構建的成熟肽原核表達質粒pET32a(+)-coIFN-γ在IPTG誘導表達下,成功在BL21細胞中表達了40 kDa左右的蛋白質,這為coIFN-γ走向臨床應用創造了條件。

相比于其他經濟動物,目前對于白羽鵪鶉IFN的應用研究報道還較少[14],本試驗從分子水平上對鵪鶉IFN進行研究,并建立IFN-γ成熟肽原核表達系統,實現表達,這為進一步研究鵪鶉干擾素蛋白在抗病毒作用和調節免疫等方面的作用提供了堅實的理論依據,并且為雞形目的免疫進化機制研究提供豐富資料。

參考文獻:

[1] Storey M,Jordan S.An overview of the immune system[J].Nurs Stand,2009,23(15-17):47-56,58,60.

[2] Stark G R.How cells respond to interferons revisited:from early history to current complexity[J].Cytokine Growth Factor Rev,2007,18(5-6):419-423.

[3] 張月美,陳偉業,葛金英,等.牛γ干擾素單克隆抗體的制備與抗原捕獲ELISA檢測方法的建立[J].中國預防獸醫學報,2009,31(12):953-957.

[4] 張巍,李紹章,杜金平.中國鵪鶉研究概況[J].湖北農業科學,2012,51(24):5 572-5 575.

[5] 張增峰,羅殿中,樊曉暉.鵪鶉流感病毒SA受體的分布特點及其在流感病毒生態系統中的作用[J].廣西醫學,2010(11):1 313-1 317.

[6] 林德軍,譚明芬.鵪鶉常見病的防治措施[J].當代畜牧,2015,(03):17-18.

[7] 張全,孫惠民,石春軍.鵪鶉肺型曲霉菌病的診斷[J].吉林畜牧獸醫,2010,9(01):17.

[8] Plachy J,Weining K C,Kremmer M J,et al.Proctive effects of typeⅠand typeⅡinterferon toward Rouse Sarcoma virus-induced tumors in chicken[J].Virology,1999(256):85-88

[9] 李皓洋.雞干擾素α和γ在家蠶中的表達及其抗病毒活性檢測[D].北京:中國農業科學院,2015.

[10] Karpala A J,Morris K R,Broadway M M,et al.Molecular cloning,expression,and characterization of chicken IFN-lambda[J].J Interferon Cytokine Res,2008,28(6):341-350.

[11] 曾巖,任曉峰,蔡皓,等.重組雞γ-干擾素對H5亞型禽流感滅活苗的免疫增強作用[J].東北農業大學學報,2010,43(10):87-90.

[12] 姜新發,吳晶娥,沈志華,等.干擾素與黃芪多糖對雞傳染性囊病治療效果[J].當代畜牧,2008(08):10-12.

[13] Marcus P L,Heide V D,Sekellick M J.Interferon action on Avain virus[J].J Administ Chicken Interf Cytokine Res,1999,(19):881-885.

[14] 夏春,汪明,朱凌云,等.惠陽胡須雞IFN-α基因克隆和序列分析[J].畜牧獸醫學報,2000,31(06):563-566.