新疆阿克蘇地區牛傳染性鼻氣管炎病毒與牛副流感病毒3型感染的檢測

廉德平,倪宏斌,凌 晨,張 坤,剡根強

(1.新疆阿拉爾新農乳業有限責任公司,新疆 阿拉爾 843300;2.石河子大學動物科技學院,新疆 石河子 832003)

牛傳染性鼻氣管炎(IBR)又稱“紅鼻病”或“壞死性鼻炎”,病原為牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV),屬于皰疹病毒科(Herpesviridae)皰疹病毒亞科(Alphaher pesviridae)水痘病毒屬(Varicellovirus)。自1956年 Madin等[1]首次從患牛中分離IBRV以來,美國、澳大利亞、新西蘭、俄羅斯、墨西哥等國家相繼出現IBRV感染的報道;我國于20世紀70年代從荷蘭進口牛中發現該病,20世紀80年代初由周泰沖等[2]首次從新西蘭進口的奶牛中分離到IBRV,顏邦芬[3]、鄒世穎[4]等的調查表明,我國大部分地區都已存在IBRV感染;目前只有瑞典、丹麥、芬蘭、奧地利等極少數國家沒有IBRV感染或者已宣布成功消除該病[5-6],世界動物衛生組織(OIE)將該病列為 B類疾病[7]。臨床感染表現為流鼻涕、呼吸困難、上呼吸道及氣管黏膜發炎等癥狀,還可引起牛的結膜炎、乳腺炎、幼牛腦膜炎、膿皰性外陰-陰道炎、龜頭炎、流產等疾病。IBRV可在牛體內長期存在甚至終身帶毒,從而造成牛的持續性感染,對奶牛的產奶量、育肥牛的增重、使役牛的使役力及公牛的繁殖力均有較大影響;繼發細菌與支原體感染可引起牛的支氣管炎和/或肺炎,治療不及時往往導致牛的死亡,大大增高了牛群的淘汰率和死亡率。現在沒有治療IBR的特效藥物,國內也沒有有效的上市疫苗。

牛副流感是由牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus 3,BPIV-3)引起的一種熱性接觸性傳染病。BPIV-3屬于單股負鏈RNA病毒目副黏病毒科副黏病毒亞科呼吸道病毒屬,又被稱為運輸熱病毒。自1959年Reisinger[8]等首次在美國分離到BPIV-3以來,法國、日本、前蘇聯、澳大利亞、加拿大、丹麥、巴拿馬和意大利等國家也相繼出現該病毒感染的報道[9];我國在近期才開始研究該病毒,根據最近幾年的文獻報道,BPIV-3己經在我國內蒙古、黑龍江、吉林、山東、山西和新疆等地存在[10-11]。臨床感染表現從無明顯的臨床癥狀到嚴重的呼吸道疾病:大部分感染BPIV-3的牛僅表現出流鼻涕、咳嗽、發熱等癥狀;但某些存在應激的牛則表現出嚴重的組織損傷和免疫抑制,繼發細菌感染則表現為肺炎以及肺部、胸腔的出血性敗血癥;并且該病毒常與牛呼吸道合胞體病毒混合感染,使病情更加復雜[12]。目前該病在世界范圍內流行,尤其是美洲和亞洲,每年都給養牛業造成嚴重的經濟損失[13]。我國對該病的研究較少,也沒有相關有效的疫苗。

為了調查阿克蘇地區是否存在IBRV和BPIV-3的感染,本試驗從該地區兩個規模化奶牛場采集18份可疑發病犢牛鼻液樣品,通過采用雙抗體夾心ELISA、PCR、RT-PCR的方法來檢測兩種病毒,為兩種疫病的防控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品 于2015年2月從阿克蘇兩個規模化奶牛場采集1月齡以內表現呼吸道癥狀的犢牛鼻液樣品18份,其中A場11份,B場7份,保存于-80℃低溫冰箱備用。

1.2 主要試劑 IBRV、BPIV-3抗原雙抗體夾心ELISA試劑盒(TSZ)。購自上海酶聯生物科技有限公司;病毒DNA提取試劑盒(Cat:9766)、反轉錄試劑盒,購自TaKaRa公司;TRIZol購自美國Invitrogen生命技術有限公司;引物合成于北京華大基因科技有限公司;PCR MIX、DNA Marker,購自廣州東盛生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理 將樣品從-80℃低溫冰箱取出,置于4℃冰箱融化。向裝有采樣棉簽的5 mL凍存管中加2 mL的生理鹽水,充分振蕩搖勻,使棉簽上的鼻液完全溶解,吸取1.2 mL的鼻液懸液于

1.5 mL的離心管中,10 000 r/min(4℃)離心 15 min,取全部上清液,經 0.22 μm 微孔濾膜過濾,得到待分離病毒樣品,-80℃保存備用。

1.3.2 抗原ELISA檢測 采用商品化牛傳染性鼻氣管炎病毒與牛副流感病毒3型抗原雙抗體夾心ELISA試劑盒,按照試劑盒說明書進行具體操作。

1.3.3 IBRV PCR檢測

1.3.3.1 病毒DNA提取 將處理好的病毒樣品從-80℃低溫冰箱取出,置于4℃冰箱融化。IBRV DNA使用TaKaRa公司病毒提取試劑盒(Cat:9766)提取。(1)取200 μL處理過的樣品溶液裝于1.5 mL 的 EP 管中,加入 200 μL Buffer VGB、20 μL Proteinase K 和1.0 μL Carrier RNA,充分混勻后,放入56℃水浴鍋溫浴反應10 min;(2)加入200 μL無水乙醇,用移液槍充分吸打均勻;(3)將Spin Column安置于 Collection Tube上,溶液移至 Spin Column中,12 000 r/min離心2 min,棄濾液;(4)將500 μL的Buffer RWA加入至Spin Column中,12 000 r/min離心1 min,棄濾液;(5)將700 μL的Buffer RWB沿管壁加入至Spin Column中,12000 r/min離心1 min,棄濾液;(6)重復步驟(5);(7)將Spin Column安置于Collection Tube上,12000 r/min離心2 min;(8)將Spin Column安置于新的1.5 mL Rnase free collection tube上,再向Spin Column膜的中央加入30～50 μL的Rnase free dH2O,室溫靜置5 min;(9)12 000 r/min離心2 min洗脫DNA,即得到病毒DNA。

1.3.3.2 引物合成 參考倪宏斌等設計的IBRV gD基因引物合成一對檢測引物,上游:5′-ACTGAACGCTGGCACACTAC-3′,下游:5′-TAGCCCTTCGACTCCTCAAA-3′,預期擴增片段大小為671 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.3.3 gD基因的PCR擴增 PCR反應組分:PCR Mix 10 μL,上、下游引物各 0.5 μL,模板 3 μL,ddH2O補至25 μL。PCR擴增條件為:預變性95℃5 min,變性94℃ 45 s,退火58℃ 45 s,延伸 72℃1 min,35個循環,72℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3.4 BPIV3 RT-PCR檢測

1.3.4.1 總RNA提取 使用TRIZol對全部處理過的樣品提取病毒總RNA。(1)取200 μL樣品上清液加入到經1‰DEPC水浸泡且高壓滅菌過的1.5 mL離心管中,加入1 mL TRIZol,充分振蕩混勻,冰上放置15 min;(2)加入200 μL氯仿,混勻,冰上放置8 min,12 000 r/min(4℃)離心15 min;(3)將離心產生的上清液全部用移液槍移入一新的1.5 mL離心管內(注意不要吸到沉淀),體積的異丙醇加入到離心管中,冰上放置20 min,12 000 r/min(4℃)離心15 min,棄上清,超凈臺內干燥20 min;(4)沿管壁加入75%DEPC水乙醇1 mL,7 500 r/min(4℃)離心5 min,棄乙醇;超凈臺中干燥30 min;(5)向離心管中加入15 μL DEPC水,溶解后即得到病毒RNA,-40℃凍存備用或直接用反轉錄。

1.3.4.2 反轉錄 使用TaKaRa反轉錄試劑盒,具體操作如下:(1)DNA的除去反應,反應組分見表1。

(2)反轉錄反應,反應組分見表2。

表2 反轉錄反應組分

(3)85℃瞬時熱激5 s即得到反轉錄產品。

1.3.4.3 引物合成 參考倪宏斌等設計的BPIV-3 gM基因引物合成一對檢測引物,上游:5′-TGATGATGCCCATATAACCAGA-3′, 下 游:5′-ATTCAAAATCCCCAAGTCCA-3′,預期擴增片段大小為394 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3.4.4 gM基因的PCR擴增 反應組分:PCR Mix 10 μL,上、下游引物各 0.5 μL,模板 3 μL,ddH2O補至25 μL。擴增條件為:預變性 95℃ 5 min,變性94℃ 30 s,退火56.6℃ 30 s,延伸72℃45 s,35個循環,72℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結果

2.1 ELISA檢測結果 使用IBRV抗原雙抗體夾心ELISA方法檢測出4份陽性樣品,檢出率為22.23%,使用BPIV-3抗原雙抗體夾心ELISA方法未檢測出BPIV-3。

2.2 IBRV PCR檢測結果 將采集的樣品經PCR擴增可得到預期671 bp大小的基因片段,見圖1。PCR方法檢測出13份陽性樣品,其中A場8份,B場5份,總檢出率為72.22%。

圖1 PCR檢測結果

2.3 BPIV-3 RT-PCR檢測結果 將采集的樣品經RT-PCR檢測,可擴增得到預期394 bp大小的基因片段,見圖2.RT-PCR方法檢測出8份陽性樣品,檢出率為44.44%;其中4份同時檢測出IBRV,檢出率為22.22%。

圖2 RT-PCR檢測結果

3 討論

3.1 阿克蘇市周邊地區是南疆奶牛規模化養殖最集中的地區,約有3萬余頭荷斯坦奶牛,本次調查僅對兩個奶牛場具有呼吸道癥狀的犢牛鼻拭子進行了IBRV和BPIV-3檢測,結果顯示,PCR方法檢測 IBRV,檢出13份陽性樣品,感染率為72.22%;RT-PCR檢測BPIV-3,檢出8份陽性樣品,感染率為44.44%。說明在阿克蘇地區存在IBRV和BPIV-3的感染,且IBRV的感染率較高,兩個牛場均檢出較多的陽性樣本,提示該地區牛場應實施IBRV疫苗的免疫接種,以有效控制該病的發生及擴散。

3.2 18份樣品中有4份樣品同時檢測出IBRV和BPIV-3,說明在阿克蘇地區存在IBRV和BPIV-3的混合感染,感染率為22.22%。

3.3 抗原雙抗體夾心ELISA方法,IBRV的檢出率為22.22%,BPIV-3的檢出率為0%,遠低于PCR與RT-PCR方法的檢出率,說明檢測牛鼻液中的兩種病毒,使用PCR與RT-PCR方法更合適。這種檢測差異同Socha W.和Rola J.等報道的一致[14]。

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