新疆南疆牛冠狀病毒BCV-Aks-01株分離及基因型鑒定

張瑩鈺,張迎春,王青青,胡建軍,王 娜,彭安業,張婉琪,崔 鑫

(1.塔里木大學生命科學學院,新疆 阿拉爾 843300;2.新疆生產建設兵團第一師畜牧獸醫工作站,新疆 阿拉爾 843300;3.塔里木大學動物科學學院,新疆 阿拉爾 843300)

牛冠狀病毒(Bovine coronavirus,BCoV)引起成年牛冬痢、新生犢牛腹瀉和呼吸道疾病的主要病原。成年牛冬季嚴重水樣腹瀉,發病率高、死亡率低,而犢牛感染多見于1周齡內,腹瀉常發生于7～10日齡,以水樣性腹瀉為主要表現,嚴重影響犢牛生長性能。牛冠狀病毒與輪狀病毒感染相似,且兩者容易混合發生,進而導致死亡率升高。感染冠狀病毒的患畜可通過糞便向環境排毒,即使癥狀恢復后18個月的時間里,仍可排出具有侵襲力的病毒[1],給養牛業可持續健康發展帶來嚴重影響。

近年來,隨著新疆養牛業不斷發展,犢牛腹瀉發病率呈上升趨勢,該病已經成為危害養牛業的主要傳染病之一。因此,開展犢牛腹瀉病原鑒定對疫病防控具有重要意義。本研究采用HCT-8細胞系,從新疆南疆某規模牛場疑似感染BCoV的犢牛糞便樣品中分離到1株病毒,依據冠狀病毒基因組中高度保守N基因作為基因分型基礎設計特異性引物,運用RT-PCR進行基因分型鑒定,為該病的診斷、防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源 新疆南疆某規模化牛場,犢牛春、冬季出現嚴重性腹瀉、脫水,呈淡黃色或灰白色水樣性糞便,并混有腸黏膜。病理剖檢,腸黏膜脫落、腸系膜淋巴結腫大。發病犢牛經抗生素治療無效。無菌采集病死犢牛腸系膜淋巴結、腸內容物等樣品,保存備用。

1.2 主要試劑 病毒檢測用RNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、pGM-T克隆試劑盒、質粒小提試劑盒等,購自天根生化科技(北京)有限公司;GoTap Green Master Mix,購自Promega生物技術有限公司;RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit,購自Thermo科技有限公司;HCT-8細胞,購自武漢博士德生物工程有限公司;胰蛋白酶、胎牛血清、1640營養液、PBS等,購自美國HyClone公司。

1.3 冠狀病毒參考毒株 文章中涉及的冠狀病毒參考株均下載于NCBI中GenBank。

1.4 樣品處理 無菌取腹瀉犢牛腸道內容物,PBS處理成10%懸液,經4 000 r/min(4℃)離心10 min取上清,通過 0.22 μm的濾膜過濾兩次。儲存于-80℃備用。

1.5 病毒分離培養 HCT-8細胞復蘇并傳至形態穩定,且細胞密度約80%左右時棄去營養液,PBS清洗2次,棄去清洗液。取1.5 mL處理后的樣品于無菌離心管中加1.5 μL胰蛋白酶,CO2培養箱中37℃培養1 h,再接種于HCT-8細胞上,CO2培養箱中37℃作用2 h,期間每隔20 min輕輕搖晃1次,最后向細胞瓶加入10 mL維持液,置于CO2培養箱37℃培養。每隔12 h觀察1次。72 h收獲培養液。收獲液反復凍融3次,再接種于HCT-8細胞,連續盲傳4～5代。每12 h鏡檢觀察細胞病變(Cytopathic Effect,CPE),待細胞病變后脫落面積達到50%左右收毒,-80℃保存備用。

1.6 樣品RNA的提取 取病毒CPE培養液,-80℃反復凍融3次,參照“病毒檢測用RNA提取試劑盒”說明書操作提取RNA,于-80℃保存備用。

1.7 cDNA第一鏈的合成 取模板RNA 2 μL加入離心管中,oligo(dT)18引物 1 μL、無核酸酶的ddH2O至12 μL,65℃孵育5 min,冰上冷卻,離心。按照順序加入:5X Reaction Buffer 4 μL、RiboLockTMRNA 酶抑制劑 (20 U/μL)1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、RevertAidTMM-MuLV 逆轉錄酶(200 U/μL)1 μL,總體積 20 μL。 42 ℃孵育 60 min,70 ℃加熱5 min終止反應。

1.8 引物 根據GenBank上BCoV U00735 Mebus參考毒株,利用DNA Star和Prime 5.0設計1對針對BCoV高度保守基因N基因的特異性引物,序列如下:BCV-P1:5′-GAGCGTCCTTTGGAAATCGT-3′;BCV-P1:5′-GCTTAGTTACTTGCTGTGGC-3′,預計擴增片段為730 bp,引物序列由上海先工生物工程技術服務有限公司合成。

1.9 RT-PCR反應擴增體系 以 BCV-P1、BCV-P2引物進行PCR反應,采用50 μL反應體系:Go Tap Green Master Mix 25 μL,引物 P1、P2 各1 μL,模板 cDNA5 μL,ddH2O18 μL 混勻后瞬時離心。PCR反應條件:94℃預變性5 min;95℃變性50 s,56℃退火45 s,72℃延伸50 s,30個循環;72℃延伸10 min。取5 μL PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,凝膠成像儀中觀察,確定所擴增片段大小。

1.10 PCR產物純化回收、克隆及測序 取PCR擴增產物電泳切膠后,按照DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物。取膠回收RT-PCR產物連接到pGEMT載體上,再轉化至DH5α大腸桿菌感受態細胞中得到重組菌,挑取白色單菌落,進行PCR鑒定,陽性菌落搖菌,提取質粒。樣品送北京金锘銳杰基因科技有限公司測序。

1.11 序列分析 測序結果在NCBI中進行Blastn,利用DNAStar軟件對BCV-Aks-01株與GenBank參考株N基因的核苷酸及氨基酸同源性進行比較分析,并繪制N基因遺傳進化樹。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀、病理變化 病牛表現體弱消瘦,初期有輕度發熱,后期體溫變低。厭食,精神沉郁,水樣腹瀉,糞便為淡黃色或乳白色帶有黏液。病理剖檢,可見腸系膜淋巴結腫大,腸道黏膜脫落。抗生素治療無效,嚴重者出生一周內死亡。

2.2 病毒分離結果 病毒接種于HCT-8細胞第1代未出現CPE變化,第4代后開始出現單層細胞大小不一的空洞,細胞變圓呈拉網狀,形成漂流體(圖1,a),而對照組則無CPE出現(圖1,b)。

圖1 BCV分離培養

2.3 RT-PCR擴增結果 出現CPE的細胞培養物經提取RNA,采用冠狀病毒N基因特異性引物(BCVP1/BCVP2),RT-PCR擴增,電泳得到730 bp大小的片段,與預期的目的片段大小相符(圖2)。

圖2 BCV-Aks-01株的RT-PCR鑒定

2.4 BCV-Aks-01株N基因核苷酸同源性分析 應用DNAStar軟件,將下載的15個冠狀病毒科參考株N基因與BCV-Aks-01株的N基因片段進行核苷酸同源性比較(見表1)。結果顯示,BCV-Aks-01片段與下載BCoV毒株的N基因核苷酸同源性為97.5%～98.6%,同BCoV參考毒株 Mebus同源性為97.8%,與國內 BCoV-YC(中國/2006,牛,FJ556872.1)、BCoVHLJ14(中國/2014,牛,KM985634.1)核苷酸同源性分別為97.5%、97.9%。而與其他參考序列相比,核苷酸同源性不足50%。將本試驗所得測序序列提交到NCBI中 GenBank,獲得登錄號:KT247647.1,命名為BCV-Aks-01。

2.5 BCV-Aks-1N基因遺傳進化樹分析 根據冠狀病毒N基因序列核苷酸同源性比較分析,構建BCVAks-1株與冠狀病毒科參考株N基因遺傳進化樹,如封二彩版圖3所示。BCV-Aks-1與BCoV-YC、BCoVHLJ14、BCoV-F04(法國/2008,牛,KT318086.1)、BCoV-V270(德國/2006,牛,EF193074.1)、BCoVMebus(Mebus/2003,牛,U00735.2)、BCoV-Quebec(加拿大/1999,牛,AF220295.1)、BCoV-0502(韓國/2008,牛,EU401981.1)、BCoV-DB2(美國/1983,牛,DQ811784.2)毒株親緣關系均較近,屬于Betacoronavirus;而 MCoV-HKU13(中國香港/2015,文鳥,NC011550.1), 屬于 Deltacoronavirus;IBVBeaudette(英國/2002,雞蛋,M95169.1)、TCoV-ATCC(美國/2008,雞蛋,EU022526.1)、BWCoV-SW1(美國/2008,白鯨,EU111742.1),屬于 Gammacoronavirus;FCoVVR2202(美國/1979,貓,DQ010921.1)、TGV-MAD(美國/2005,豬,AJ271965.2)、CCoV-NTU336(中國臺灣/2010,犬,GQ477367.1),屬于 Alphacoronavirus。

3 討論

牛冠狀病毒是致犢牛腹瀉的主要病原之一,呈世界性分布。1972年美國的Mebus等[2]在新生犢牛腹瀉糞便中首次檢出BCoV。國內學者亦報道我國有BCoV的存在。1985年宋廣林[3]等采用電鏡在犢牛腹瀉樣本中檢測到BCoV存在。姚火春[4]等(1990)在我國牛群中使用血凝抑制試驗檢測牛冠狀病毒杭體,陽性率為80.2%,BCoV在我國普遍存在,同時也證實新疆 BCoV也存在。胡傳偉[5]等(2006)在東北三省進行冠狀病毒血清學調查,BCoV抗體陽性率100%。

新疆南疆某規模牛場新生犢牛出現水樣性腹瀉為主的癥狀,本研究結合新疆南疆某牛場犢牛腹瀉發病情況、發病特征、病理變化,對腹瀉死亡犢牛的腸內容物采用HCT-8細胞上盲傳4代后出現細胞病變,收獲細胞培養物。以冠狀病毒N基因設計特異性引物,RT-PCR檢測,證實該牛場犢牛存在牛冠狀病毒感染。由于該病毒的樣本來源于病死犢牛的腸內容,牛輪狀病毒與冠狀病毒常混合感染。為了鑒別診斷牛冠狀病毒是否與其他病毒混合感染,本研究同時應用了牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉-黏膜病毒的特異性引物進行了RT-PCR鑒別診斷,未獲得目的片段。說明該病死犢牛感染冠狀病毒,而未有牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉-黏膜病毒混合感染的現象。張坤[6]等(2015)開展的新疆北疆部分地區規模化奶牛場致犢牛腹瀉冠狀病毒的分子流行病學調查,也證實北疆地區規模牛場腹瀉犢牛存在牛冠狀病毒感染。上述分析說明在新疆地區規模牛場存在牛冠狀病毒感染的情況。

根據國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)第九次報告中確立的冠狀病毒分類地位,冠狀病毒為套式病毒目(Nidovirales),冠狀病毒科(Coronaviridae)。該科下又分為冠狀病毒亞科(Coronavirinae)和環曲病毒亞科(Torovirinae)。冠狀病毒亞科進一步分為Alpha-、Beta-、Gamma-以及新假定的屬Deltacoronavirus共4大類[7]。通過對冠狀病毒N基因核苷酸同源性、遺傳進化樹的比較及分析,BCV-Aks-01株與參考毒株 BCoV-YC、BCoV-HLJ14、BCoVF04(法國/2008,牛,KT318086.1)、BCoV-V270(德國/2006,牛,EF193074.1)、BCoV-Mebus(Mebus/2003,牛,U00735.2)、BCoV-Quebec(加拿大/1999,牛,AF220295.1)、BCoV-0502(韓 國/2008,牛,EU401981.1)、BCoV-DB2(美國/1983,牛,DQ811784.2)均屬于Betacoronavirus。

本研究在病毒分離的基礎上[8],采用RT-PCR方法進行病毒檢測,提高了鑒定的準確性。為新疆南疆地區規模牛場感染牛冠狀病毒病綜合防控的制定提供了重要參考依據,也豐富了新疆牛冠狀病毒分子流行病學資料。

參考文獻:

[1] Woods R D,Wesley R D.Transmissible gastroenteritis coronavirus carrier sow[J].Adv Ecp Med Biol,1998,440:641-647.

[2] Mebu s C A,St air E L,Rhodes M B.Pathology of neon at al cal f diar rhea induced by a coron aviru s-l ike agent[J].Vet Pathol,1973,10:45-64.

[3] 宋廣林,董惠蘭,滕慶,等.犢牛流行性腹瀉病原研究[J].畜牧獸醫學報,1985,16(2):121-122.

[4] 姚火春,杜念興,徐為燕,等.牛冠狀病毒的血清流行病學調查[J].南京農業大學學報,1990,13(2):117-121.

[5] 胡傳偉,賈赟,簡中友,等.東北三省冠狀病毒流行病學調查[J].黑龍江畜牧獸醫,2006,12:88-89.

[6] 張坤,剡根強,王靜梅,等.新疆北疆部分地區致犢牛腹瀉冠狀病毒的分子流行病學調查[J].中國獸醫科學,2015,45(12):1 270-1 276.

[7] Virus taxonomy,classification and nomenclature of viruses:ninth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.San Diego,CA:Academic Press,2012.

[8] 關新,樸范澤,侯喜林.牛冠狀病毒的分離鑒定[J].黑龍江八一農墾大學學報,2007,19(2):55-58.