土木香提取物抑制金黃色葡萄球菌毒力因子分泌作用的研究

湯法銀,劉桓妤,李文華,鄧旭明,王建鋒

(1.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130062;2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院制藥工程學(xué)院,河南 鄭州 450046;3.長春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林 長春 130117)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),廣泛分布于自然界中,是臨床上常見的人獸共患病原菌,可引起人和動(dòng)物的多種致死性感染,也可導(dǎo)致食物中毒或胃腸炎等。金黃色葡萄球菌也是奶牛乳房炎主要致病菌之一,嚴(yán)重威脅乳業(yè)的發(fā)展。日益嚴(yán)重的耐藥性使得金黃色葡萄球菌感染的治療更加復(fù)雜化。金黃色葡萄球菌致病機(jī)制相關(guān)研究結(jié)果表明,金黃色葡萄球菌在宿主體內(nèi)建立感染與其分泌的各種外毒素密切相關(guān),且金黃色葡萄球菌致病力與其表達(dá)毒力因子的能力呈正相關(guān)[1-3]。

金黃色葡萄球菌可分泌超過30余種的外毒素,包括α-溶血素、腸毒素和毒性休克綜合征毒素-1(TSST-1)等[3-4]。α-溶血素是由致病性金黃色葡萄球菌分泌的一種成孔毒素,一般以單體形式分泌,可與多種宿主細(xì)胞,如紅細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞等結(jié)合并在靶細(xì)胞細(xì)胞膜形成一個(gè)七聚體的跨膜通道,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外溢及細(xì)胞死亡[5-6]。腸毒素和TSST-1是金黃色葡萄球菌分泌的超抗原蛋白,是引起金黃色葡萄球菌食物中毒和中毒性休克綜合征的主要致病毒力因子。該類毒素分子量為20～30 kDa,可直接與細(xì)胞表面的MHCⅡ類分子結(jié)合,活化宿主T淋巴細(xì)胞并誘導(dǎo)腫瘤壞死因子(TNF-α)等細(xì)胞因子的釋放[7-8]。

已有研究報(bào)道,多種天然化合物或中藥提取物可抑制金黃色葡萄球菌外毒素的分泌,部分揭示了中藥抗病原菌感染機(jī)制。土木香作為臨床常用中藥,具有健脾和胃、行氣止痛的功效,化學(xué)成分豐富,藥理活性多樣[9-10]。然而土木香對(duì)金黃色葡萄球菌毒力因子表達(dá)的影響尚未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 耐藥性金黃色葡萄球菌USA 300,購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC);雌性BALB/c小鼠(6～8周,體重20～22 g)購自吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑 土木香根,購自安徽亳州市;乙醇,購自天津新通精細(xì)化工有限公司;蛋白免疫印跡分析所需的抗體(抗金黃色葡萄球菌α-溶血素、腸毒素A、TSST-1多克隆抗體和HRP標(biāo)記的二抗)、ECL發(fā)光液和溶葡萄球菌素,購自Sigma公司;TaKaRa RNA PCR kit(AMV)Ver.3.0和SYBR Premix Ex TaqTM來自TaKaRa公司;ELISA MAXTMStandard SET Mouse TNF-α來自Biolegend公司;脫纖維兔血,購自森貝伽(南京)生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 土木香提取物制備 土木香根粉碎過篩,稱取藥材20 g,加入200 mL 95%乙醇,35℃震蕩(140 r/min)浸提3 h,減壓抽濾,濾渣再次加入200 mL 95%乙醇,35℃震蕩(140 r/min),浸提3 h,減壓抽濾,合并上述兩次濾液,減壓濃縮得到提取物,-4℃保存?zhèn)溆?使用前用DMSO溶解。

1.3.2 最小抑菌濃度測(cè)定 根據(jù)CLSI(Clinical And Laboratory Standards Institute)公布的標(biāo)準(zhǔn)方法,采用肉湯微量稀釋法測(cè)定土木香提取物對(duì)金黃色葡萄球菌USA 300的最小抑菌濃度(MIC)。

1.3.3 溶血試驗(yàn) 金黃色葡萄球菌USA 300培養(yǎng)于TSB培養(yǎng)基至對(duì)數(shù)生長前期(OD600nm值=0.3),分別加入不同濃度(16、32、64 μg/mL 和 128 μg/mL)土木香提取物,繼續(xù)培養(yǎng)(37℃,200 r/min)至對(duì)數(shù)生長后期(OD600nm值=2.5),10 000 r/min離心1 min,收集培養(yǎng)物上清。 875 μL PBS、100 μL 培養(yǎng)物上清和25 μL脫纖維兔血反應(yīng)體系混勻后置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育20 min,10 000 r/min離心1 min,收集反應(yīng)體系上清并檢測(cè)樣品的吸光度值(OD543nm)。去離子水為陽性對(duì)照組,設(shè)定為100%溶血,PBS設(shè)定為陰性對(duì)照組,0%溶血,每組樣品溶血比例與陽性對(duì)照組做比。

1.3.4 腫瘤壞死因子(TNF-α)釋放試驗(yàn) 雌性BALB/c小鼠(6～8周,體重20～22 g)頸椎脫臼處死后,無菌操作收集小鼠脾淋巴細(xì)胞并培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中48 h,鋪板于96孔板中(1×106個(gè)細(xì)胞/孔)。

金黃色葡萄球菌USA 300過夜培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中后按1∶30比例擴(kuò)大培養(yǎng)于RPMI 1640,分別加入不同濃度土木香提取物(16、32、64 μg/mL和128 μg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)(37 ℃,200 r/min)4 h,離心(10 000 r/min,1 min)收集培養(yǎng)物上清,0.2 μm 的濾膜過濾培養(yǎng)物上清,-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

50 μL上述培養(yǎng)物上清加入已鋪板的96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi),培養(yǎng)(37℃,5%CO2)16 h,離心(1 000 r/min離心10 min)取上清,應(yīng)用 Mouse TNF-α ELISA MAXTMSet Standard檢測(cè)試劑盒分析樣品內(nèi)TNF-α含量。

1.3.5 生長曲線測(cè)定 金黃色葡萄球菌USA 300培養(yǎng)于TSB培養(yǎng)基至對(duì)數(shù)生長前期(OD600nm值=0.3),分別加入不同濃度(16、32、64 μg/mL 和 128 μg/mL)土木香提取物,繼續(xù)培養(yǎng)(37℃,200 r/min)并每隔30 min檢測(cè)每個(gè)樣品的吸光度值(OD600nm)。

1.3.6 免疫印跡分析 金黃色葡萄球菌USA 300培養(yǎng)于TSB培養(yǎng)基至對(duì)數(shù)生長前期(OD600nm值=0.3),分別加入不同濃度(16、32、64 μg/mL 和 128 μg/mL)土木香提取物,繼續(xù)培養(yǎng)(37℃,200 r/min)至對(duì)數(shù)生長后期(OD600nm值=2.5),10 000 r/min離心1 min,收集培養(yǎng)物上清。培養(yǎng)物上清上樣于SDS-PAGE并應(yīng)用半干式轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h,一抗(抗金黃色葡萄球菌α-溶血素、腸毒素A、TSST-1多克隆抗體)常溫孵育2 h,HRP標(biāo)記的二抗常溫孵育2 h,應(yīng)用ECL發(fā)光液檢測(cè)目的蛋白含量。

1.3.7 熒光定量PCR分析 金黃色葡萄球菌USA 300培養(yǎng)于TSB培養(yǎng)基至對(duì)數(shù)生長前期(OD600nm值=0.3),分別加入不同濃度(16、32、64 μg/mL 和128 μg/mL)土木香提取物,繼續(xù)培養(yǎng)(37℃,200 r/min)至對(duì)數(shù)生長后期(OD600nm值 =2.5),10 000 r/min離心1 min,收集細(xì)菌。溶葡萄球菌素(100 μg/mL)重懸菌體孵育(37℃,10 min),應(yīng)用 Qiagen RNeasy Maxi column提取菌體RNA,TaKaRa RNA PCR kit(AMV)Ver.3.0試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒 PCR擴(kuò)增,通過△△Ct法分析基因的相對(duì)表達(dá)水平,以gyrBRNA為持家基因。熒光定量PCR試驗(yàn)引物見表1,PCR反應(yīng)體系(25 μL)循環(huán)參數(shù)為:95℃ 變性30 s,95℃5 s,55℃ 30 s,72℃ 40 s,運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。

表1 熒光定量PCR引物

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)照組加入等量的溶劑(DMSO),數(shù)據(jù)以X±SD表示,均來自3次獨(dú)立試驗(yàn)結(jié)果,應(yīng)用Prism 5.0對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn),P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 土木香提取物無抗金黃色葡萄球菌活性 最小抑菌濃度試驗(yàn)結(jié)果表明,土木香提取物對(duì)金黃色葡萄球菌USA 300的MIC高于1 024 μg/mL,提示土木香提取物對(duì)受試金黃色葡萄球菌無抗菌活性。當(dāng)不同濃度土木香提取物(16、32、64 μg/mL和128 μg/mL)與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)后,所有藥物處理組對(duì)金黃色葡萄球菌生長幾乎無任何影響(圖1),進(jìn)一步提示土木香提取物處理對(duì)金黃色葡萄球菌生長無抑制作用。

圖1 土木香提取物與金黃色葡萄球菌USA 300共培養(yǎng)生長曲線

2.2 土木香提取物抑制金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物上清溶血活性 溶血試驗(yàn)是篩選潛在的抗金黃色葡萄球菌α-溶血素抑制劑的經(jīng)典方法。如圖2所示,土木香提取物與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)后,培養(yǎng)物上清的溶血活性顯著降低,當(dāng)土木香提取物濃度為16、32、64 μg/mL 和128 μg/mL,培養(yǎng)物上清溶血活性從無藥物處理組的89.26%(樣品與100%溶血陽性對(duì)照相比)下降至 81.43%、44.19%、15.31% 和4.92%,且這一抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。

圖2 土木香提取物與金黃色葡萄球菌USA 300共培養(yǎng)后培養(yǎng)物上清溶血活性

2.3 土木香提取物抑制金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物上清刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞釋放TNF-α的活性金黃色葡萄球菌腸毒素和TSST-1都具有超抗原活性,可刺激脾淋巴細(xì)胞釋放TNF-α。金黃色葡萄球菌USA 300培養(yǎng)物上清與小鼠脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后可顯著刺激宿主細(xì)胞釋放TNF-α,但土木香提取物處理后可顯著降低培養(yǎng)物這一刺激活性,且這一作用與土木香提取物抑制細(xì)菌α-溶血素分泌作用相類似,也明顯呈現(xiàn)濃度依賴性(圖3)。

圖3 土木香提取物與金黃色葡萄球菌USA 300共培養(yǎng)后培養(yǎng)物上清誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞釋放TNF-α活性

2.4 土木香提取物抑制金黃色葡萄球菌外毒素的表達(dá) 溶血試驗(yàn)和小鼠脾淋巴細(xì)胞TNF-α釋放試驗(yàn)結(jié)果表明,土木香提取物處理后可降低培養(yǎng)物上清介導(dǎo)的溶血活性和刺激淋巴細(xì)胞TNF-α釋放的活性。為了進(jìn)一步證實(shí)上述抑制作用是否是由于土木香提取物處理抑制金黃色葡萄球菌外毒素表達(dá),本研究通過蛋白免疫印跡試驗(yàn)分析了金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物上清α-溶血素、腸毒素和TSST-1的含量。結(jié)果如圖4所示,土木香提取物處理后顯著降低金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物上清α-溶血素、腸毒素和TSST-1的表達(dá)。

2.5 土木香提取物抑制金黃色葡萄球菌hla、sea、tst和agrA基因轉(zhuǎn)錄 金黃色葡萄球菌二元調(diào)控系統(tǒng)agrA是調(diào)控外毒素表達(dá)的重要的調(diào)控子,本研究進(jìn)一步分析了土木香提取物對(duì)金黃色葡萄球菌α-溶血素、腸毒素A和TSST-1編碼基因hla、sea和tst以及其正向調(diào)控系統(tǒng)agrA轉(zhuǎn)錄的影響。結(jié)果如圖5所示,與無藥物處理對(duì)照組相比,土木香提取物處理后金黃色葡萄球菌hla、sea、tst和agrA轉(zhuǎn)錄明顯降低。 藥物濃度為 128 μg/mL 時(shí),hla、sea、tst和agrA 分別下調(diào)了 6.57、5.58、5.07 倍和 7.05 倍。 這一抑制作用與藥物抑制細(xì)菌α-溶血素、腸毒素和TSST-1分泌相一致。

圖5 土木香提取物與金黃色葡萄球菌USA 300共培養(yǎng)hla、sea、tst和agrA基因相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

抗生素主要是通過抑制靶細(xì)菌DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的形成而清除宿主體內(nèi)的病原菌,但這一作用機(jī)制給予病原菌選擇壓力較大,較易誘導(dǎo)耐藥性的發(fā)生和發(fā)展。近年來由于抗生素的濫用等因素導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性越演越烈,已成為21世紀(jì)亟待解決的世紀(jì)性難題。萬古霉素等被認(rèn)為是防治金黃色葡萄球菌等耐藥性病原菌感染的最后一道防線,但是隨著耐萬古霉素金黃色葡萄球菌及“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn),臨床上對(duì)于金黃色葡萄球菌感染治療日益艱難。隨著人們對(duì)病原菌致病機(jī)制的逐步深入研究,以病原菌毒力因子為靶標(biāo)的抗毒力策略日益受到多個(gè)領(lǐng)域的科研人員關(guān)注。與傳統(tǒng)抗生素殺菌或抑菌活性不一致,由于毒力因子常常不是細(xì)菌生命所必需的成分,因此抗毒力策略給予靶細(xì)菌選擇壓力較小,不易誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性[11]。

本試驗(yàn)通過溶血試驗(yàn)和脾淋巴細(xì)胞TNF-α釋放試驗(yàn)對(duì)耐藥性金黃色葡萄球菌毒力因子抑制劑進(jìn)行篩選,初步發(fā)現(xiàn)土木香提取物與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)后可顯著降低金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物上清中α-溶血素和超抗原(腸毒素A和TSST-1)的活性。這一抑制作用需要較高濃度的提取物,當(dāng)濃度低于或等于16 μg/mL,土木香提取物對(duì)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物上清溶血活性和超抗原刺激活性無顯著影響,但當(dāng)濃度等于或高于32 μg/mL,土木香提取物與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)后可顯著降低細(xì)菌培養(yǎng)物上清溶血活性和抗原刺激活性。抗菌活性試驗(yàn)研究表明,在土木香提取物有效活性濃度范圍內(nèi)(16、32、64 μg/mL 和 128 μg/mL),藥物對(duì)金黃色葡萄球菌生長幾乎無影響,提示這一抑制作用不是由于土木香提取物抑制金黃色葡萄球菌生長所導(dǎo)致的,表明土木香提取物對(duì)金黃色葡萄球菌選擇壓力較小,不易誘導(dǎo)耐藥性的發(fā)生和發(fā)展。

為了進(jìn)一步研究土木香提取物對(duì)金黃色葡萄球菌毒力因子作用,蛋白免疫印跡分析發(fā)現(xiàn),土木香提取物與耐藥性金黃色葡萄球菌USA 300共培養(yǎng)后,可顯著抑制金黃色葡萄球菌α-溶血素、腸毒素A和TSST-1的表達(dá),表明土木香提取物是抗金黃色葡萄球菌感染的潛在的抗毒力先導(dǎo)復(fù)合物。熒光定量PCR試驗(yàn)表明,土木香提取物處理可顯著降低上述毒力蛋白編碼基因(hla、sea和tst)及二元調(diào)控系統(tǒng)agrA的轉(zhuǎn)錄。金黃色葡萄球菌外毒素表達(dá)受到多個(gè)調(diào)控系統(tǒng)組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制[12-14],因此本研究結(jié)果表明,土木香提取物抑制金黃色葡萄球菌外毒素表達(dá)部分依賴于藥物降低agrA二元調(diào)控系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄。

已有研究表明,部分傳統(tǒng)抗生素治療會(huì)誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌外毒素分泌而加重臨床感染[15],提示土木香提取物可與抗生素聯(lián)合用藥以改善這一不良作用。另外,土木香提取物以細(xì)菌毒力因子為靶標(biāo),對(duì)細(xì)菌選擇壓力小,也可減少或部分替代抗生素的使用,降低細(xì)菌耐藥性及延長抗生素的使用壽命。

4 結(jié)論

土木香提取物處理可顯著降低金黃色葡萄球菌USA 300主要毒力因子α-溶血素、腸毒素A和TSST-1的表達(dá),這一抑制作用部分通過降低金黃色葡萄球菌二元調(diào)控系統(tǒng)agrA的轉(zhuǎn)錄。研究結(jié)果提示,土木香提取物是一種潛在的抗金黃色葡萄球菌感染先導(dǎo)復(fù)合物。

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