工程化陽離子脂質體在核酸遞送中的應用

柯長洪

摘 要：隨著納米技術與生物醫學的發展，納米材料用于核酸藥物遞送具有廣泛的應用前景。核酸分子（質粒DNA、反義寡核苷酸和小分子干擾RNA）在細胞中以可控的方式進行表達，其在未來疾病的治療和機制研究中起著非常重要的作用，包括基因治療，基因疫苗以及小分子干擾RNA對細胞功能及信號干擾的研究。然而， 由于核酸藥物自身負電荷性與帶負電荷的細胞膜產生排斥作用，游離核酸很難進入到靶細胞中發揮作用。基于納米材料攜帶核酸遞送主要瓶頸在于既能高效、特異性的將核酸藥物遞送到靶細胞中同時又不會對機體產生毒副作用和引起免疫原性。本綜述對近年來用于核酸藥物遞送所面臨的挑戰和陽離子脂質體的設計原則及其應用進行闡述。同時對開發新的陽離子脂質體用于臨床核酸藥物遞送提供一定的借鑒。

關鍵詞：核酸遞送；陽離子脂質體；納米材料；非病毒載體

1、前 言

本文對核酸遞送過程中所面臨的障礙以及陽離子脂質體結構特征包括親水性頭、疏水性尾以及兩者之間的鏈接鍵linker對細胞轉染影響和細胞毒性進行綜述，為合成新的陽離子脂質體在體內外用于核酸遞送提供一定借鑒意義。

2. 核酸治療中主要障礙

2.1細胞外遞送（Extracellular delivery）

納米載體包裹核酸藥物遞送到病灶部位進行靶向治療，能夠避免裸核酸（DNA/RNA）在血液循環過程中被酶水解，提高基因治療效果。外源性物質進入機體后，很容易受到由單核巨噬細胞組成的網狀內皮系統（RES）排出體外。

2.2 細胞攝取（Cell Targeting and uptake ）

核酸藥物只有在細胞內才能有效地發揮作用，包裹核酸藥物的納米粒子即使成功逃脫網狀內皮細胞捕獲而未能將藥物分子傳輸到細胞內，同樣很難取得比較好的治療效果。細胞對納米粒子的吸收主要通過網格蛋白、小窩蛋白介導的胞飲，巨胞飲和吞噬作用和網格/小窩非依賴性的內吞。

2.3 內涵體釋放（endosome release）

外源性物質通過內吞方式進入細胞，與細胞膜表面相關的蛋白進行融合依次形成初級內涵體、早期內涵體、晚期內涵體、自噬體以及自噬溶酶體等。一旦攜帶有核酸的納米粒子通過內吞進入自噬溶酶體后，在溶酶體內低pH值和各種蛋白水解酶作用下，核酸就會被降解排出體外從而使核酸藥物失效。

3. 納米工程化陽離子脂質體用于核酸藥物遞送

基于納米材料包裹核酸藥物遞送所存在的以上障礙，能夠用于細胞內核酸遞送的納米材料必須具備以下優勢：第一，能夠保護核酸藥物免于核酸酶的降解；第二，有助于核酸跨過細胞膜后能夠順利從早期內涵體中逃離出來進入到細胞質和細胞核中；第三，具有良好的生物相容性，對細胞和機體毒副作用低；第四，在血液中能夠長效循環而不被網狀內皮細胞捕獲從而提高藥物的利用度；第五，靶向性強，避免非特異性吸附以及為了達到治療效果而提高的藥物濃度所產生的細胞毒副作用。

3.1 親水性頭陽離子脂質體對細胞轉染影響

相對病毒載體而言，非病毒載體最大的不足就是轉染效率低，為了盡可能提高陽離子作為基因載體的轉染效率，目前普遍采用的是季銨鹽陽離子親水性頭，因為其在任何溶液pH值環境下均帶正電荷能夠促進細胞對陽離子脂質體的內吞。有研究表明，在親水性季銨鹽頭上用帶羥基的烷基取代原來的甲基之后，其轉染效率顯著增強達到甚至超過市售lipo2000的轉染效率。另外，有研究表明在季銨鹽頭上引入兩個甚至三個羥基烷基頭不僅有助于提高脂質體的轉染效率，同時由于引入更強親水性基團導致的細胞毒性會降低。

3.2 疏水性尾對細胞轉染影響

作為陽離子脂質體另一個重要組成部分疏水性鏈，其結構影響著脂質體相轉變溫度、與中性脂質體DOPE（二油酰磷脂酰乙醇胺）形成納米脂質體雙層膜流動性及穩定性、DNA免于酶的降解、內涵體的逃逸、DNA的釋放和核膜的穿透，還有細胞毒性等，而所有這些因素都會直接決定合成的陽離子脂質體能否用于核酸遞送，轉染效率有多高以及目的基因最終表達水平。因此，對疏水鏈的鏈長、疏水鏈的數目、鏈的種類（脂肪鏈和類固醇鏈），鏈的飽和度如何影響細胞轉染進行了討論。

脂肪鏈中含有的不飽和鍵對轉染效果有著顯著影響。Koynova合成了兩種陽離子脂質體用于DNA遞送，這種脂質體區別在于一個是使用帶有不飽和鍵的的油酸作為疏水鏈，而另一種則是含有飽和烴的硬脂酸作為疏水鏈，結果發現，含有油酸的陽離子脂質體遞送DNA能力顯著優于硬脂酸陽離子脂質體。不飽和脂肪鏈陽離子脂質體不足之處就在于穩定性比較差，含有的不飽和鍵容易被氧化而不能長期保存。

3.3 鏈接親水性頭和疏水性尾巴linker對細胞轉染影響

在所有陽離子脂質體中連接親水性頭和疏水鏈尾的鏈接鍵幾乎都包含了醚鍵、酯鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵以及二硫鍵。這些鏈接鍵主要是通過影響陽離子脂質體對細胞和組織的生物毒性，從而降低陽離子脂質體對靶細胞和組織的轉染效果。例如含有醚鍵的DOTMA（N-1-（2，3-二油酰氧基）丙基-N，N，N-三甲基氯化銨）雖然轉染效率比較高，但是由于脂質體中含有的醚鍵難以降解對細胞的毒性比較大；而將其中的醚鍵換成酯鍵后的DOTAP（（2，3-二油酰基-丙基）三甲基氯化銨），在不改變轉染效率的前提下降低了對細胞的毒性。Ilies合成了兩種帶吡啶頭的陽離子脂質體，一種是以酰胺鍵作為linke，另一種是以酯鍵作為linker來比較這兩種脂質體對細胞轉染的影響。結果表明，相對于酯鍵，酰胺鍵較高熔點和較低的相轉變溫度導致其化學穩定性更強，因而轉染效率高；而由于酯鍵的相對不穩定因而細胞毒性更低。為了兼顧酯鍵的低細胞毒性和酰胺鍵的高轉染效率，近年來，人們對基于氨基甲酸酯作為linker的陽離子脂質體研究也越來越重視。由于氨基甲酸酯在中性環境下如正常生理環境（pH 7.4）能夠穩定存在，而一旦溶液的pH值降低（如在內涵體中pH 5～6）就會酸性催化水解從而將包裹的核酸藥物釋放出來，同時脂質體自身被水解成沒有毒性的小分子排出體外。谷胱甘肽（GSH）——含有巰基的肽，其在細胞質中的濃度是血漿的 500-1000 倍左右，這也為設計含有二硫鍵的陽離子脂質體用于核酸遞送提供思路36。其它具有光敏感和pH敏感的linker陽離子脂質體也被開發用于核酸遞送。

綜上所述，作為陽離子脂質體三個重要組成部分的親水性頭、疏水性尾和中間的鏈接鍵linker，每個部分在核酸遞送中都起著至關重要的作用，但是這三者并不是獨立的，而是相輔相存。因此在設計開發新的陽離子脂質體時，應該從以下幾個方面進行考慮：第一，DNA和RNA的壓縮程度；第二，盡可能通過增強陽離子脂質體與細胞膜之間的相互作用促進納米載體的內吞；第三，膜的融合能力既能有利于納米脂質體通過細胞質膜進入細胞質，同時有利于從內涵體中逃逸出來避免進入溶酶體被降解；第四，設計合成的陽離子脂質體細胞毒性更低，生物相容性更好。