白茶對糖尿病模型小鼠降血糖作用的研究

劉犀靈，任發(fā)政，2，雷新根，3，侯彩云，2

(1北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院/食品質量安全北京實驗室，北京 100083；3美國康奈爾大學動物科學系，紐約 14853)

糖尿病是一種與胰島素分泌障礙及能量代謝紊亂相關的慢性疾病[1-3]。茶葉中含有豐富的活性物質，具有抗氧化[4]、預防肥胖[5]、增強免疫[6]等多種功效，其降血糖作用及機理被廣泛報道[7]。作為具有芽型茶和葉型茶的白茶[8-9]，卻缺少相關的研究。因此，本研究選取芽型茶白毫銀針、芽葉型茶白牡丹及多葉型茶壽眉三種白茶作為研究對象，并以多葉型茶類黃大茶作為對照，構建誘發(fā)性糖尿病小鼠模型，對此4種茶葉水提物(TWEs)的降血糖效果進行評價，并進一步探究作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白毫銀針、白牡丹、壽眉及黃大茶，購于北京市馬連道茶城。SPF級雄性4w齡ICR小鼠，許可證號SCXK(京)2016-0011，北京維通利華實驗動物技術有限公司；40%脂肪供能高脂高糖飼料及小鼠維持飼料，上海普路騰生物科技有限公司；鏈脲霉菌素(Streptozotocin，STZ)，美國Sigma公司；鹽酸二甲雙胍，北京協(xié)和藥廠；Trizol試劑，碧云天生物科技有限公司；反轉錄試劑盒(5X All-In-One RT Master)，美國abm公司；實時熒光定量試劑盒(EvaGreen 2X qPCR MasterMix-No Dye)，美國abm公司；小鼠內參引物GAPDH，上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設備

FA2004分析天平；DHG-9070A型電熱鼓風干燥箱；SHZ-III循環(huán)水真空泵；RE-52AA真空旋轉蒸發(fā)儀；真空冷凍干燥機；Roche血糖儀活力型；Chemray 240全自動生化分析儀；DY89—II電動玻璃勻漿器；Epoch酶標檢測儀；JY92—IIn超聲細胞粉碎機；Thermofisher Nanodrop 2000核酸蛋白檢測儀；Biometra T-personal 梯度PCR儀；Roche lightcycler 96熒光定量PCR儀；Eppendorf 54180R低溫超速離心機等。

1.3 方法

1.3.1 茶葉水提物的制備與成分分析 將茶葉用粉碎后過40目篩備用，準確稱取粉碎茶樣，按1∶15的茶水比，80～90℃水浴浸提1h，過濾后將濾渣用同樣方法浸提，合并兩次濾液，55℃旋轉蒸發(fā)濃縮濾液，將濃縮液真空冷凍干燥，得到白毫銀針水提物(TWE-YZ)、白牡丹水提物(TWE-MD)、壽眉水提物(TWE-SM)和黃大茶水提物(TWE-HC)，密封包裝，4℃保存?zhèn)溆肹10]。采用福林酚法測定TWEs茶多酚總量[11]、蒽酮—硫酸比色法測定TWEs茶多糖含量[12]、三氯化鋁比色法測定TWEs總黃酮[13]。

1.3.2 構造糖尿病模型與分組 購買小鼠于屏障環(huán)境動物房(溫度22±2℃、濕度50%±5%、壓差20～50Pa、12/12h光暗循環(huán))，適應性喂養(yǎng)7d后，隨機選取10只作為正常對照組(NC)喂養(yǎng)維持飼料，其余換成高脂高糖飼料，連續(xù)喂養(yǎng)4w后，隔夜禁食12h，將STZ溶解于pH 4.2～4.5的檸檬酸鹽緩沖液，給小鼠腹腔注射STZ 110mg/kg·BW，1w之后測定血糖，空腹血糖(FBG)≥11.1mmol/L，造模成功[14]。并按照FBG隨機分組為模型對照組(MC)、陽性對照組(PC)、TWE-YZ干預組、TWE-MD干預組、TWE-SM干預組、TWE-HC干預組，每組10只小鼠。

1.3.3 劑量設計 茶葉人體推薦劑量為9.0g/60kg·BW[15]，參照保健功能食品評價規(guī)范，設置人體推薦劑量的30倍作為干預劑量，且TWEs的提取率為33%±5%，得到小鼠的灌胃劑量為1.5g/kg·BW。PC組選用鹽酸二甲雙胍藥物干預，根據(jù)成人的每日最大劑量(1～1.5g)，換算成小鼠用藥劑量為250mg/kg·BW[16]。

1.3.4 葡萄糖耐量實驗 在4w干預結束前，所有小鼠隔夜禁食不禁水15h，測定FBG，作為0時血糖。然后給小鼠灌胃葡萄糖1.5g/kg·BW，記錄灌胃后30、60、90、120min血糖，并繪制時刻—血糖折線圖[17]。按照式(1)計算折線圖的曲線下面積。

AUC/(mmol·h/L)=(A/2+B+C+D+E/2)/2

(1)

式(1)中，A、B、C、D、E分別表示0、30、60、90、120min時刻的血糖值。

1.3.5 生化指標檢測 干預結束后，所有鼠禁食12h，眼眶采血，將血樣在4℃、3 500r/min離心15min，分離血清樣本分別測定血清胰島素水平(FIS)和FBG。

1.3.6 胰腺組織病理學分析 取小鼠胰腺組織于組織固定液，固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，做切片，H&E染色，光學顯微鏡觀察胰腺組織病理學變化，200倍視野下拍照。

1.3.7 實時熒光定量PCR檢測 Trizol法提取小鼠肝臟總RNA[18]，檢測RNA的濃度及OD260/OD280比值，將比值在1.8～2.0的樣品用于反轉錄合成cDNA。取1μL的cDNA，上下游引物各0.3μL，ddH2O補充至10μL，按照梯度程序：95℃、10min，95℃、15 S，60℃、60 S循環(huán)35次。并以GAPDH為內參基因，采用2-(ΔΔCT)法[19]對糖代謝相關基因表達水平進行分析。所測基因為硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP)、叉頭轉錄因子(Foxo1)、葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PEPCK1)(表1)。

表1 引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2.1 TWEs主要功效成分含量

如表2所示，白茶TWEs的茶多酚含量明顯高于TWE-HC大約為1.3～1.6倍。三種白茶TWEs中，芽型茶TWE-YZ的茶多酚含量顯著高于多葉型茶TWE-SM和芽葉型茶TWE-MD(P<0.05)。可見，茶葉生產工藝和原料的嫩度影響茶葉的茶多酚含量。

表2 TWEs的主要功效成分 單位：mg/g

注：字母不同表示差異顯著，P<0.05

由表2可知，茶多糖含量與茶葉嫩度相關，其中多葉型茶TWE-HC和TWE-SM茶多糖最高，芽葉型茶TWE-MD次之，芽型茶TWE-YZ最低，呈現(xiàn)梯度下降的規(guī)律。此外，對TWEs的黃酮類化合物總量進行測定發(fā)現(xiàn)，白茶TWEs的總黃酮含量相對較高，大約為TWE-HC的1.4倍。白茶TWEs中，TWE-SM和TWE-YZ黃酮含量較高，TWE-MD次之，未呈現(xiàn)與茶葉嫩度相關的梯度規(guī)律。

2.2 TWEs對糖尿病小鼠體重、攝食量及始末血糖的影響

由圖1A可以看出，除NC和PC組外，所有組體重均有明顯的降低，從第3周開始，TWEs組體重趨于穩(wěn)定，而MC組體重波動較大，整體趨于降低。從圖1B可以看出，只有NC組和PC組體重呈現(xiàn)正增長，而MC組及其他TWEs干預組均呈現(xiàn)出負增長，推測與注射STZ造成糖尿病模型有關，并且二甲雙胍對維持小鼠正常體重具有較好作用。TWEs干預組中，YZ組與SM組體重增長百分比顯著高于MC組(P<0.05)，說明TWE-YZ與TWE-SM有利于緩解糖尿病所造成的小鼠體重減輕癥狀，其他兩種TWEs也有所緩解，但沒有顯著性。

由圖1C可以看出，除NC組外，小鼠的攝食量都明顯增加，出現(xiàn)了多食癥狀。并且MC組和PC組小鼠攝食量一直偏高，而TWEs組攝食量相對較小，低于MC組與PC組，說明TWEs干預可以一定程度上減輕小鼠的多食癥狀，而二甲雙胍作用較弱。

由圖1D可以看出，注射STZ后，測定了初始血糖值，糖尿病模型鼠組別之間沒有顯著差異(P>0.05)，并且FBG均在20mmol/L左右。MC組經過4w喂養(yǎng)后，F(xiàn)BG有一定升高，說明MC組小鼠的糖尿病病情不斷惡化。TWEs干預組中，F(xiàn)BG均有一定程度降低，PC組、YZ組、MD組、SM組及HC組的血糖下降率分別為35.5%、21.7%、27.3%、34.8%及25.1%。可以看出，TWE-SM降血糖的效果最好，其作用效果與鹽酸二甲雙胍接近，其次為TWE-MD。

圖1 TWEs對小鼠體重、攝食量及始末血糖值的影響注：*與正常組相比，P<0.05；**P<0.01；#與模型組相比，P<0.05；##P<0.01(下同)

圖2 TWEs對小鼠葡萄糖耐量的影響

2.3 TWEs對糖尿病小鼠葡萄糖耐量的影響

口服葡萄糖耐量實驗可以確診糖尿病[21]。圖2A表明，MC組血糖在30min時明顯升高，之后血糖雖有降低，但非常緩慢，表現(xiàn)出葡萄糖不耐受。TWEs組及PC組血糖在30min驟升之后，血糖恢復得相對較快，但難以區(qū)分各組間的差異性。由圖2B可知，TWEs及二甲雙胍均對小鼠葡萄糖耐受有一定程度的改善，其中PC組、HC組的AUC顯著低于MC組(P<0.05)，而SM組則極顯著低于MC組(P<0.01)，顯示出了較好的效果。結合表2可知，TWE-SM和TWE-HC的茶多糖含量均較高，并且TWE-HC的茶多糖含量大約是TWE-SM的1.8倍，但是TWE-HC改善小鼠葡萄糖耐量的效果卻不如TWE-SM。推測可能是由于TWE-SM的茶多酚、茶多糖及黃酮含量均相對較高，三者之間存在某種協(xié)同機制，改善小鼠的葡萄糖不耐受，進而降低小鼠血糖。Zhou等[22]分別以茶葉水提物(TWE)、粗茶多糖(CTP)及精制茶多糖(TPF)為原料，用四氧嘧啶誘導昆明小鼠建立糖尿病模型，研究上述三類物質的降血糖效果。結果表明，CTP降血糖效果最好，TPF次之。同樣證明了茶葉中起降血糖作用的并非單一組分，而是多種組分互相協(xié)調的結果。

2.4 TWEs對HOMA模型的影響

根據(jù)小鼠FBG和FIS計算出了胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)和胰島β細胞功能指數(shù)(HOMA-B)，這種計算方式是基于肝臟葡萄糖的輸出和胰腺胰島素的分泌呈動態(tài)平衡，計算公式為[23]：HOMA-IR=FBG*FIS/22.5；HOMA-B=(20*FIS)/(FBG-3.5)%。由圖3A和3B可以看出，TWEs及二甲雙胍均對小鼠HOMA-IR有一定改善，其中MD組效果最好，HOMA-IR值顯著低于MC組(P<0.05)。而HOMA-B值SM組最高，與NC組沒有顯著差異(P>0.05)。由此可見，不同TWEs均可調節(jié)FBG與FIS之間的平衡，但是其調節(jié)方式有所差異。

2.5 小鼠胰腺組織的病理學分析

如圖4所示，NC組胰島形態(tài)正常，胰島細胞排列成團成索，染色淺；外分泌部為染色較深的漿液腺泡，腺細胞成錐形，細胞基部胞質呈強嗜堿性，頂部胞質含嗜酸性分泌顆粒，核大，圓形，近細胞基部。而MC組胰島細胞變性，排列紊亂；基膜增厚，胰島細胞核空泡化；胰島捏毛細血管擴張。MC組胰島細胞壞死，有脂肪變性征兆，胰島損傷較為嚴重。而PC組胰島細胞變性、壞死，核固縮、深染；毛細血管擴張；周圍結締組織增生，少量炎性細胞浸潤，胰島損傷同樣較為嚴重，可見二甲雙胍藥物對胰腺組織病理學形態(tài)的改善并不顯著。YZ組胰島細胞出現(xiàn)肥大，腦漿空泡化。MD組胰島細胞核深染。SM組胰島肥大，淋巴細胞浸潤；胰島細胞變性，核固縮、深染。HC組胰島細胞內出現(xiàn)了毛細血管擴張。可見，TWEs均在不同程度上改善了胰腺組織的病理學形態(tài)。

圖3 TWEs對HOMA模型的影響

圖4 小鼠胰腺組織病理學分析

圖5 TWEs對糖代謝相關基因表達的影響

2.6 TWEs對糖代謝相關基因表達的影響

由圖5A可知，MC組小鼠肝臟的TXNIP表達極顯著升高(P<0.01)，TWEs的干預均使TXNIP的表達量極顯著降低(P<0.01)，其中YZ和MD組的效果優(yōu)于SM和HC組。TXNIP是胰島細胞的炎癥分子，可介導胰島β細胞的凋亡。可見，四種TWEs均可下調TXNIP的表達量，減緩胰島細胞炎癥，抑制TXNIP所介導的β細胞凋亡[24]。由圖5B可知，MC組小鼠肝臟的Foxo1表達顯著升高(P<0.05)，TWEs的干預均使Foxo1的表達量極顯著降低(P<0.01)，且各組間沒有顯著差異。Foxo1是胰島β細胞的關鍵調控因子，可β細胞的增殖，促進糖異生相關基因的表達，使得胰島素的分泌量減少，葡萄糖的生成量增加，血糖升高[25-26]。由圖5C可知，SM組的GLUT4表達量顯著高于NC組(P<0.05)，而GLUT4可激活葡萄糖蛋白轉運受體，促進葡萄糖的吸收與利用[27]。由此可見，TWE-SM可通過上調GLUT4的表達量來提高糖尿病鼠的葡萄糖利用效率，進而達到降低糖尿病小鼠血糖的作用。由圖5D可知，MC組和HC組PEPCK1的表達量顯著高于NC組(P<0.01)，3種白茶TWEs干預均使其表達量顯著下調(P<0.01)，且三者無顯著差異。PEPCK1是糖異生的關鍵調控基因，促進葡萄糖的合成。因此，3種白茶TWEs通過下調糖異生的關鍵調控基因，進而抑制葡萄糖合成路徑。

3 結論

在實驗所設劑量下，白毫銀針、白牡丹、壽眉及黃大茶水提物均可降低小鼠血糖，其中壽眉水提物最為明顯，白牡丹水提物次之；四種茶葉水提物均可改善小鼠葡萄糖耐量，其中壽眉水提物具有極顯著作用，黃大茶水提物有顯著作用；白牡丹水提物可顯著改善小鼠胰島素抵抗。綜上所述，多葉型茶壽眉改善糖尿病小鼠病癥效果較好。白毫銀針和白牡丹水提物可通過下調TXNIP、Foxo1及PEPCK1的表達量，來減緩胰島細胞炎癥，抑制胰島β細胞的凋亡，并抑制糖異生通路；壽眉水提物通過上調GLUT4的表達量，下調PEPCK1的表達量，促進葡萄糖的吸收與利用，并抑制糖異生通路，直接調節(jié)了血糖水平。黃大茶水提物也可調控部分基因的表達量，但效果不如白茶顯著。因此，三種白茶均有降血糖功效，而且多葉型茶壽眉的降血糖效果更為明顯，優(yōu)于同為多葉型茶的黃大茶，推測是由于壽眉茶多酚與茶多糖含量均較高的緣故，而茶多酚與茶多糖協(xié)同降血糖的機理，還有待進一步研究。◇

[1]American Diabetes Association.Diagnosis and classification of diabetes mellitus[J].Diabetes Care，2014，37(Suppl 1)：S81-90.

[2]繆海韜，顧衛(wèi)瓊.青少年1型和2型糖尿病遠期轉歸的比較[J].中國糖尿病雜志，2014，6(12)：910-912.

[3]黃世杰.二甲雙胍在2型糖尿病初始藥物治療中的作用：亞洲—太平洋地區(qū)展望[J].國際藥學研究雜志，2007，34(5)：387-389.

[4]呂海鵬，張悅，陳興華，等.不同花色種類白茶的抗氧化活性及其主要品質化學成分分析[J].食品科學，2016，37(20)：42-50.

[5]Xu Y，et al.The anti-obesity effect of green tea polysaccharides，polyphenols and caffeine in rats fed with a high-fat diet[J].Food & Function，2015，6(1)：297.

[6]李海珊，劉麗喬，聶少平.茶多糖對小鼠腸道健康及免疫調節(jié)功能的影響[J].食品科學，2017，38(7)：187-192.

[7]陸鵬，王校常，汪瑛琦.茶葉在抵抗Ⅱ型糖尿病中的作用[J].浙江大學學報(農業(yè)與生命科學版)，2016，42(3)：358-367.

[8]Han M，et al.Safety and anti-hyperglycemic efficacy of various tea types in mice[J].Scientific Reports，2016，6：31703.

[9]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 30766—2014茶葉分類[M].北京：中國標準出版社，2014-10-27.

[10]中華人民共和國衛(wèi)生部門.保健食品檢驗與評價技術規(guī)范(2003年版)[S].北京：衛(wèi)生部衛(wèi)生法制與監(jiān)督司編印，2003：11-12.

[11]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 8313—2008.中華人民共和國國家標準—茶葉中茶多酚和兒茶素含量的檢測方法[M].北京：中國標準出版社，2008-05-04.

[12]傅博強，謝明勇，聶少平，等.茶葉中多糖含量的測定[J].食品科學，2001，22(11)：69-73.

[13]馬陶陶，張群林，李俊，等.三氯化鋁比色法測定中藥總黃酮方法的探討[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19(1)：54-56.

[14]Islam M S，Loots T D.Experimental rodent models of type 2 diabetes：a review[J].Methods & Findings in Experimental & Clinical Pharmacology，2009，31(4)：249.

[15]王蝶.茶葉對肥胖大鼠的減肥作用及機制研究[D].湖南農業(yè)大學，2012.

[16]黃繼漢，黃曉暉，陳志揚，等.藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算[J].中國臨床藥理學與治療學，2004，9(9)：1069-1072.

[17]玄光善，潘士佳，南姬.桑葉有效成分降糖作用研究[J].食品科學，2011(7)：323-326.

[18]Simms D，Chomczynski P.TRIzolTM：a new reagent for optimal single-step isolation of RNA[J].Focus，1993.

[19]Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J].Methods，2012，25(4)：402-408.

[20]Wolfram S，Raederstorff D，Preller M，et al.Epigallocatechin gallate supplementation alleviates diabetes in rodents[J].Journal of Nutrition，2006，136(10)：2512.

[21]李競，葉迎春，李芳林，等.口服葡萄糖耐量試驗在糖尿病診斷中的價值[J].中國實用內科雜志，2003，23(8)：494-495.

[22]Zhou X，et al.Effects of soluble tea polysaccharides on hyperglycemia in alloxan-diabetic mice[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry，2007，55(14)：5523-5528.

[23]Tang W，Li S，Liu Y，et al.Anti-diabetic activity of chemically profiled green tea and black tea extracts in a type 2 diabetes mice model via different mechanisms[J].Journal of Functional Foods，2013，5(4)：1784-1793.

[24]Shalev A.Lack of TXNIP protects β-cells against glucotoxicity[J].Biochemical Society Transactions，2008，36(Pt 5)：963-965.

[25]黃荷.Foxo1對糖尿病胰腺β細胞的作用[J].內科，2009，4(3)：404-407.

[26]Hou X，Song J，Li X N，et al.Metformin reduces intracellular reactive oxygen species levels by upregulating expression of the antioxidant thioredoxin via the AMPK-FOXO3 pathway[J].Biochemical & Biophysical Research Communications，2010，396(2)：199.

[27]Li S，Chen H，Wang J，et al.Involvement of the PI3K/Akt signal pathway in the hypoglycemic effects of tea polysaccharides on diabetic mice[J].International Journal of Biological Macromolecules，2015，81：967.