HPLC法同時測定白術中白術內酯Ⅰ Ⅱ Ⅲ的含量

鄺俊維 卿萍 周子虬 鄒輝

摘 要 本研究建立了同時測定中藥白術中白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ含量的高效液相色譜法，結果表明白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ進樣量分別在76～760 ng，87～870 ng，75～750 ng范圍內線性關系良好，白術甲醇超聲提取液中白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ平均加樣回收率分別為100.20%（RSD=1.8%），100.10%（RSD=1.2%），99.68%（RSD=0.84%），白術甲醇回流提取液中白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ平均加樣回收率分別為100.67%（RSD=0.88%），100.06%（RSD=0.67%），100.67%（RSD=1.7%）.該含量測定方法簡單、快速、準確、靈敏度高、重復性好，可用于白術藥材的質量控制.超聲提取法對白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的提取效率均高于加熱回流提取法.

關鍵詞 白術；高效液相色譜法；白術內酯Ⅰ；白術內酯Ⅱ；白術內酯Ⅲ；含量測定

中圖分類號 R917文獻標識碼 A文章編號 1000-2537（2017）06-0055-06

Abstract In this work， a HPLC method has been established to simultaneously determine atractylenolideⅠ， Ⅱ， and Ⅲ in Atractylodes macrocephala Koidz. Our method has generated good linearity in the range of 76～760 ng，87～870 ng， and 75～750 ng for atractylenolideⅠ，Ⅱ， and Ⅲ，respectively. The average recoveries for these three compounds were 100.20%（RSD=1.8%）， 100.10%（RSD=1.2%）， and 99.68%（RSD=0.84%）by ultrasonic extraction， and 100.67%（RSD=0.88%）， 100.06%（RSD=0.67%）， and 100.67%（RSD=1.7%）by heating reflux extraction， respectively. The proposed method is simple， fast， accurate and reproducible， and can be used to control the quality of Atractylodes macrocephala Koidz. The ultrasonic extraction method shows higher extraction efficiency than the heating reflux extraction method.

Key words Atractylodes macrocephala Koidz； HPLC； atractylenolide Ⅰ； atractylenolide Ⅱ； atractylenolide Ⅲ； content determination

白術為菊科植物白術（Atractylodes macrocephala Koidz）的干燥根莖，為2015年版《中國藥典》收錄的國標藥材，其性味苦、甘，溫，歸脾、胃經，主治脾虛、胎動不安等[1].主產于浙江、安徽、淮北、皖南等地，為地道藥材“浙八味”之一，是藥用處方中的常用藥材，其主要活性成分為白術內酯類成分[2-3]，此外還有苷類[4]和多糖類成分[5]；近年來，研究者從白術中發現了系列多炔類成分[6]，并證實其具有顯著的抗炎作用[7].研究顯示白術具有抗衰老[8]、抗腫瘤[9-10]、鎮痛[11]等藥理作用.

白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ是白術中含量較高的化學成分，亦是白術的特征性成分，并且藥理研究表明白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ是白術的主要藥效成分[12-15]，這3種成分的含量可作為白術質量控制的指標成分.本文建立了可同時測定白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ含量的HPLC方法，并考察了不同提取方法對這3種成分含量的影響，為完善白術的質量控制提供科學依據.

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀（日本島津公司，配備低壓四元泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器、色譜工作站）；FB224自動內校電子分析天平（0.000 01 g，上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；KQ5200DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RH-800型高速多功能粉碎機（浙江榮浩工貿有限公司）；不銹鋼沖框標準篩（孔徑250 μm，即60目，長沙市思科儀器沙篩廠）.

1.2 試藥

白術藥材飲片（批號16012009，購自湖南衡岳中藥飲片有限公司）；白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ對照品（自制，經HPLC檢測，歸一法計算純度>99.0%）；甲醇（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司），乙腈（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）；純水（經0.45 μm水系濾膜過濾），其余試劑為分析純.

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ對照品于10 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解，定容至10 mL，制成濃度分別為1.869，1.912，2.178 g/L的單一對照品儲備溶液；精密吸取各單一對照品儲備液2 mL定容至25 mL，得白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ濃度分別為0.149 5，0.153 0，0.174 2 g/L的混合對照品儲備液，備用.

2.2 供試品溶液的制備

白術飲片粉碎后過篩，取白術藥材細粉2份，各約1.0 g，精密稱定，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，精密量取2份甲醇各50 mL，分別加入上述錐形瓶中，微微振搖，稱定質量.一份超聲60 min，另一份水浴回流60 min，待冷卻后，加甲醇補足溶劑揮發的量，搖勻.將提取的2份供試品溶液先用普通漏斗過濾，取續濾液分別置于50 mL錐形瓶中備用，在進樣前用0.45 μm微孔濾膜濾過.

2.3 色譜條件及系統適應性

色譜柱：Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水，梯度洗脫；洗脫程序：0～15 min，乙腈55%，15～30 min，乙腈55%～80%；檢測波長：220 nm（白術內酯Ⅰ，Ⅲ），276 nm（白術內酯Ⅱ）；進樣量：20 μL；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃.

2.4 方法可行性考察

取白術對照品溶液及供試品溶液進行分析，按“2.3”項下色譜條件進樣，得色譜圖（見圖1～3），白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ對照品的保留時間分別為9.3，16.0，23.1 min，各成分均達到基線分離，具有較好的對稱性，分離度均大于1.5，白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的理論塔板數均大于5 000.

2.5 線性關系考察

精密吸取“2.1”項下混合對照儲備液0.5 mL加適量甲醇溶解后定容至10 mL，配制成白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ分別為7.475，7.65，8.71 mg/L的混合溶液.按既定方法在色譜系統中分別進樣10，20，40，60，80，100 μL測定.以峰面積A對進樣量X （ng）進行線性回歸，求得各自的線性回歸方程為：白術內酯Ⅰ，Y=3 346.2X-27 657（r=0.998 7），線性范圍為76～760 ng；白術內酯Ⅱ，Y=3 616 X-48 059（r=0.999 4），線性范圍為87～870 ng；白術內酯Ⅲ，Y=3 242X+1 548（r=0.999 9），線性范圍75～750 ng.

2.6 精密度實驗

在“2.3”項的色譜條件下，對供試品溶液重復進樣6次，進樣量每次20 μL，分別測定白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的峰面積，計算RSD分別為0.28%，0.26%，0.16%，表明儀器精密度良好.

2.7 重復性實驗

取同一批次的白術飲片細粉12份，每份約1.0 g，精密稱定，其中6份按超聲提取方法制成供試品溶液，6份按回流提取方法制成供試品溶液，按“2.3”項的色譜條件色譜條件進樣，測得超聲提取供試品溶液中白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ含量的RSD分別為2.5%，2.0%，2.8%，回流提取白術供試品溶液中白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ含量的RSD分別為0.74%，2.2%，2.0%，表示該方法重復性良好.結果見表1，2.

2.8 穩定性實驗

分別取“2.2”項下制備得到的兩種供試品溶液，在0，2，4，6，8，12和24 h進樣，測定峰面積，計算得到超聲提取白術供試品溶液的白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ峰面積的RSD分別為1.4%，2.1%，2.4%，回流提取白術供試品溶液的白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ峰面積的RSD分別為0.76%，2.7%，2.4%，結果表明兩種供試品溶液在24 h內穩定性良好.結果見表3，4.

2.9 加樣回收率

取已按既定方法測定含量的白術細粉12份，每份約1.0 g，精密稱定，其中6份置于50 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對照儲備液2.0，2.5，3.0 mL，加甲醇至50 mL，按超聲提取方法制成供試品溶液；另6份置于250 mL圓底燒瓶中，分別精密加入混合對照儲備液2.0，2.5，3.0 mL，加甲醇至50 mL，按回流提取方法制成供試品溶液；按“2.3”項的色譜條件下進樣，分別測定兩種提取方法下3種成分的含量，計算回收率.結果超聲提取白術供試品溶液白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的平均加樣回收率分別為100.20%（RSD=1.8%），100.10% （RSD=1.2%），99.68% （RSD=0.84%）；回流提取白術供試品溶液白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ平均加樣回收率分別為100.06（RSD=0.88%），100.30（RSD=0.67%），100.67（RSD=1.7%），結果見表5，6.

2.10 樣品含量測定

取同一批次的白術細粉6份，其中3份按超聲提取方法制成供試品溶液，另3份按回流提取方法制成供試品溶液，按“2.3”項的色譜條件下進樣，用峰面積外標法計算白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ含量，測定結果見表7，8.

3 討論

3.1 檢測波長選擇

對白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ對照品在190～800 nm進行紫外可見光譜掃描，結果顯示白術內酯Ⅰ和Ⅲ在220 nm波長有最大吸收，而白術內酯Ⅱ在276 nm有最大吸收波長，故確定220 nm為白術內酯Ⅰ和Ⅲ的檢測波長，276 nm為白術內酯Ⅱ的檢測波長.

3.2 研究意義

本文建立了同時測定中藥白術中3種主要活性成分的HPLC方法，為白術質量控制提供了實驗依據.在該方法下，分別檢測了超聲提取與加熱回流2 種提取方法下白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的含量.結果表明，超聲提取中白術內酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的含量均高于加熱回流提取，而且超聲提取較加熱回流提取具有操作簡單、方便、無需特殊裝置，相對高效等優勢，因此，本研究為選擇白術有效成分的提取方法提供了科學依據.

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