小鼠lewis肺癌原位移植瘤和異位皮下移植瘤模型的對比研究

馬雪曼 王笑民 于明薇 張甘霖 楊國旺 于 潔

肺癌作為第二大最普遍的惡性腫瘤，其死亡率在世界范圍內仍然居高不下。據統計，非小細胞肺癌則占據了肺癌總病例的85%，其中包括鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞癌[1]。在目前的治療方式下非小細胞肺癌的5年存活率僅為15%[2]，更安全有效的治療方式被迫切需要。在肺癌的新型治療方法的研究中1個主要的障礙是缺乏簡便易行的、可重復的、臨床相似度更高的動物模型。原位移植瘤和異位移植瘤相比，其優點在于腫瘤細胞生長的微環境與肺癌臨床情況相符合。在曾經常用的皮下移植瘤模型中，一些抗轉移的藥物缺乏響應，使得原位移植瘤模型更受到藥物試驗的推崇[3]。已經有很多種肺原位移植瘤模型的建立方法被報道，最常用的方法包括經氣管細胞注射法和經胸壁細胞注射法[4]。然而，由于這些肺原位移植瘤模型的建立方法缺乏簡便性和可重復性，原位移植瘤的實時監測對實驗條件、實驗儀器有較高的依賴性，其成瘤性不穩定，手術創傷大，荷瘤鼠生存時間短等局限性，大多數實驗研究依然沿用皮下移植瘤模型。本研究中，我們同時建立了生物發光的肺癌原位移植瘤模型和異位皮下移植瘤模型，對這兩種模型小鼠進行觀察，對比它們的一般情況、成瘤情況、轉移情況，并對比兩種模型的病理學差異。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

小鼠ll2-luc-m38肺癌細胞株( ATCC細胞庫，美國)，10%胎牛血清、高糖DMEM培養基、0.25%胰酶(均為Hyclone公司產品，美國)，異氟烷，河北一品制藥有限公司。一抗 VEGF(ab46154)購自Abcam Biotechnology公司。熒光素(D-Luciferin)購自美國GOLD BIOTECHNOLOGY公司，用PBS溶解稀釋為15 mg/ml的溶液，0.22 μm濾器過濾后避光保存。電子游標卡尺：上海申韓量具有限公司；小動物活體成像系統(In-vivo imagingsystem，IVIS)：美國Caliper公司；CO2培養箱：日本三洋公司；微量移液器：eppendorff公司；離心機：北京白洋醫療器械有限公司。細胞培養箱、超凈臺、電子稱等均由首都醫科大學附屬北京中醫醫院中心實驗室提供。

1.2 實驗動物

SPF級 C57BL/6純系小鼠，6～8周齡，雄性，體重19～21 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養在首都醫科大學附屬北京中醫醫院實驗動物中心無特定病原體(specificpathogen free，SPF)的飼養間，并進行無菌接種，所有實驗操作程序均經過首都醫科大學附屬北京中醫醫院實驗動物中心批準，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養及處理 將小鼠Lewis肺癌細胞置于含10%胎牛血清及高糖DMEM的完全培養基中，置于37 ℃5%CO2培養箱中培養，每1d更換培養液1次，每2 d用0.25%胰酶消化傳代一次，細胞匯合率達90%時，收集細胞，離心去上清，加入生理鹽水吹打，使細胞懸浮于生理鹽水中，臺盼藍染色細胞活力測定大于95%，并進行細胞計數，調整細胞濃度為1×107/ml、2×107/ml的細胞懸液備用。

1.3.2 注射前 Matrigel 的準備 將-20 ℃長期保存的Matrigel置于4 ℃冰箱中過夜融化，將已融化的Matrigel和2 × 107/ml 濃度的細胞懸液按 1∶ 1混勻，所有操作在冰浴中進行。

1.3.3 分組 小鼠共40 只，其中20只建立肺癌原位移植瘤模型，20只建立皮下移植瘤模型。每組10只用于觀察移植瘤的生長情況和轉移情況，另外10只用于生存曲線的測定。

1.3.4 原位肺癌動物模型的建立 麻醉：氧氣與異氟烷按比例混合對小鼠進行呼吸麻醉。 接種：將小鼠麻醉后，右側臥位置于操作臺上，對小鼠腋下剪毛并用乙醇消毒，在左腋前線肋弓上約1.5 cm處作一個5 mm大小的切口，分離皮膚及皮下組織，暴露胸壁，至能看到肺葉隨呼吸上下活動為止，將 50 μl混有Matrigel的細胞懸液用微量進樣器在室溫下放置2 min后，再注射至左肺上，進針深度約3 mm，注射后停針數秒，拔針后縫合切口[5]。

1.3.5 肺癌皮下移植瘤動物模型的建立 小鼠注射部位用75%酒精消毒，無菌注射器吸取細胞懸液，右側腋后線下2 cm處斜行入針，刺入皮下，每只注射0.1 ml的1×107/ml細胞懸液，形成圓形小皮丘，注射完按壓入針點，出針。

1.4 小鼠體重及一般情況

每周兩次使用電子天平稱量小鼠體重，觀察小鼠進食、飲水、皮毛光澤度和脫落等情況。每組隨機抽取10只小鼠觀察生存時間并記錄。

1.5 小動物活體成像系統檢測腫瘤生長和轉移情況

小動物活體成像儀每7天檢測1次荷瘤小鼠移植瘤及轉移灶腫瘤光子數。小鼠背部皮下注射200 μL底物熒光素10 min后應用小動物活體成像系統檢測皮下移植瘤生物發光及轉移情況。具體原理為：ll2-luc-m38是能穩定表達熒光素酶(luciferase，luc)的細胞株，當外源性給予底物熒光素(luciferin)時，熒光素酶催化熒光素的氧化反應，即可在體內產生發光現象，發光強度可以用小動物活體成像儀器(IVIS)進行檢測。

1.6 解剖學和病理學檢測

接種后第21天脫頸椎處死小鼠，或將已經死亡的小鼠，進行詳細的解剖并取材，檢查肺轉移及其他器官轉移情況。取出皮下移植瘤及小鼠肺臟，用10%中性甲醛固定，經脫水透明石蠟包埋，切片，HE染色及二步法免疫組化染色(VEGF)，封片，光鏡下觀察拍照。

2 結果

2.1 小鼠體重及一般情況

每周2次用電子天平稱量小鼠體重，繪制小鼠體重變化曲線(圖1)。皮下移植瘤模型組小鼠體重逐漸上升；原位移植瘤模型組小鼠體重逐漸增加，在腫瘤接種后第14天達到最高體重，隨著肺原位移植瘤的進一步增大，體重逐漸下降。兩組小鼠在接種兩周后均出現進食進水量減少，活動減少，皮毛失去光澤，有卷曲脫落的現象。

圖1 小鼠體重變化曲線

2.2 腫瘤形成和轉移情況

每7天用小動物成像儀檢測小鼠移植瘤生物發光強度。成瘤時間：肺原位移植瘤和皮下移植瘤的兩組小鼠均在接種當天檢測到微弱的生物發光，隨時間延長生物發光強度逐漸增強。皮下移植瘤和肺原位移植瘤的成瘤率均為100%。接種后第14天，肺原位移植瘤組小鼠檢測到對側胸部出現腫瘤生物發光，接種后第21天，皮下移植瘤組小鼠檢測到皮下移植瘤(右腋下)同側或對側胸部出現腫瘤生物發光。接種后第21天對小鼠進行解剖觀察：肺原位移植瘤組小鼠左肺(接種部位)可見腫瘤結節形成，部分小鼠對側肺臟亦可見腫瘤結節，同時部分小鼠出現了胸膜轉移、心包轉移、胸骨柄轉移，其中1只小鼠出現了腎臟轉移，轉移率為100%；皮下移植瘤組小鼠右側腋下(接種部位)形成一個體積較大、類圓形的腫瘤，部分小鼠肺部出現轉移灶，轉移率為70%。

2.3 病理檢測結果

皮下移植瘤呈囊實性，隨腫瘤體積增大瘤體中央可出現破潰出血，壞死、脫落。肺原位腫瘤周圍看到肺泡受壓萎縮，肺周圍組織遭受浸潤，肺泡壁增厚，炎性細胞增多。肺原位移植瘤和皮下移植瘤均表現出腺癌的病理特征，細胞形成大小不等，形狀不一，排列不規則的癌巢，細胞分化差，核大，深染，核質比增大，核分裂相多見[6]。免疫組化染色結果示，肺原位移植瘤VEGF表達高于異位皮下移植瘤。

2.4 小鼠生存情況

接種后持續觀察40天，皮下移植瘤組小鼠接種后第21天死亡1只，第28天死亡3只，第35天死亡2只，40天觀察結束時4只存活。肺原位移植瘤組小鼠接種后第14天死亡1只，第19天死亡2只，第21天死亡1只，第22天死亡1只，第23天死亡2只，第24天死亡1只，第28天死亡2只，觀察至此荷瘤小鼠全部死亡。兩組荷瘤小鼠生存曲線，見圖2。

圖2 小鼠生存曲線

3 討論

在肺癌的實驗研究中，由于異位移植法操作簡單，一直作為首選方法，但“種子和土壤學說”已經證實了腫瘤原發器官微環境會影響腫瘤細胞的生物學特征[7]，因此學者們認為異位移植瘤脫離了原發組織的微環境，其發生發展與臨床相去甚遠，同時該模型對藥物反應性差、轉移發生率較低、生存曲線數據與臨床脫節[8]。原位移植瘤模型在規避了以上不足的同時亦存在其自身的缺點，如操作復雜，有手術死亡風險，生存期短，腫瘤發生發展不易被直觀地觀察到等。本研究中，我們同時建立了生物發光的肺原位移植瘤模型和異位皮下移植瘤模型，對這兩種模型小鼠進行觀察，對比它們的一般情況、成瘤情況、轉移情況，并對比兩種模型的病理學差異。在非小細胞肺癌的實驗研究中，為研究者選擇合適的動物模型提供多角度的、更為可靠的依據。

3.1 造模方法的對比

第一，注射部位的對比。異位皮下移植瘤模型的建立中，注射部位是動物體表皮下，可選擇部位較為廣泛，國內外研究中常用的部位有背部皮下、上肢腋窩皮下、腹股溝皮下等。本研究中根據既往的預實驗選用了左上肢腋窩皮下。肺原位移植瘤模型中，其注射部位必須是肺臟，文獻中左肺注射和右肺注射均有報道。

第二，注射方法的對比。異位皮下移植瘤模型的建立采用皮下注射的方法，即無菌注射刺入皮下，注射細胞懸液后形成圓形小皮丘。肺原位移植瘤模型的注射方法有經氣管細胞注射法和經胸壁細胞注射法，前者需要小動物CT的輔助，操作相對復雜，因此本研究選用了經胸壁細胞注射法。即先將小鼠麻醉后消毒備皮，將注射部位的皮膚切開1個小口，暴露胸壁至能看到肺葉，用無菌注射器將細胞懸液注射至左肺。原位移植瘤模型的注射方法與皮下移植瘤模型對比，操作相對復雜，具有創傷性。

第三，注射物的對比。異位皮下移植瘤模型注射的細胞用無菌生理鹽水重懸，終濃度為1×107個/ml，體積為100 μl。肺原位移植瘤模型注射的細胞用混有 Matrigel的生理鹽水重懸，細胞懸液終濃度也是1×107個/ml，然而注射體積較小，為50 μl。由于小鼠肺臟本身體積較小，不宜注射體積較大的細胞懸液。同時肺臟有許多肺泡，并且不間斷的進行著呼吸運動，用Matrigel膠與腫瘤細胞相混有利于固定注射物在肺臟中的位置。并且 Matrigel膠中含有各種蛋白及生長因子，均為腫瘤的形成提供不可或缺的營養成分，有益于腫瘤細胞的快速生長[9]。

3.2 兩種模型的生物學對比

第一，荷瘤小鼠的一般狀況和生存情況對比。皮下移植瘤模型組小鼠在觀察的28天內體重逐漸上升，觀察至第40天仍有40%的荷瘤小鼠存活，考慮到皮下瘤對小鼠內臟并未產生較大的影響，因此體重持續上升，直至接種后期皮下腫瘤長勢迅猛，部分小鼠出現了肺臟轉移，因而后期才出現了惡病質。原位移植瘤模型組小鼠前14天體重逐漸增加，隨后體重逐漸下降，觀察至第28天荷瘤小鼠無一存活，可能原因是腫瘤直接接種在肺部，隨后出現全身各部位的轉移，小鼠腫瘤負荷較重，故而體重下降，并伴有較重的惡病質，小鼠生存期較短。

第二，成瘤情況和轉移情況對比。兩組模型小鼠成瘤率均為100%。皮下移植瘤模型部分小鼠出現了肺部轉移，原位移植瘤小鼠幾乎全部出現了轉移，轉移部位包括雙肺、胸壁、腎臟。皮下組織相對獨立，瘤組織被皮膚包繞，血供不足，不易出現轉移。肺原位移植瘤轉移較多，因為肺臟本身是1個血供豐富、氧氣充足、不斷進行呼吸運動的器官，腫瘤細胞很容易發生血性轉移、播種轉移。

第三，解剖和病理學對比。異位皮下移植瘤模型組的腫瘤位于皮下組織，肺原位移植瘤模型的腫瘤位于肺臟，后者肺癌細胞生長條件更符合臨床。HE染色和免疫組化染色結果亦表明，原位腫瘤組織中VEGF的表達明顯較高，符合肺部血供豐富、氧氣充足的腫瘤微環境。

綜上所述，本研究同時建立了兩種非小細胞肺癌模型，即以往常用的異位皮下移植瘤模型和臨床相符的肺原位移植瘤模型，同時利用小動物活體成像系統中的生物發光技術對比監測兩種荷瘤小鼠腫瘤形成及轉移情況。利用Matrigel建立的Lewis非小細胞肺癌原位移植瘤模型，雖然操作相對復雜，但操作方法具有可重復性，成瘤性和轉移性較好，手術死亡率為零。病理檢測結果表明肺原位移植瘤能更好的模擬人肺癌病理特征，與該疾病臨床發生發展相一致，為深入研究肺癌奠定了基礎。為確定肺原位移植瘤模型的推展價值，我們希望繼續從腫瘤微環境的角度進一步研究。

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