45種藏藥材的CDC25A/CDC25B磷酸酶抑制活性篩選△

包婷雯 左明麗,3 丁 玉 林鵬程,3*

(1.青海民族大學藥學院，青海 西寧 810007；2.青海省青藏高原植物資源化學研究重點實驗室，青海 西寧 810007；3.青海省藥物分析重點實驗室，青海 西寧 810007)

世界衛生組織預測，未來20年全世界每年新發癌癥病例將達到2200萬，同期癌癥死亡人數上漲到1300萬例[1]。其中，中國占全世界新發癌癥病例的20%[2]。所有癌癥的共同特征是癌癥發生時細胞周期混亂, 調控細胞周期的因子消失、過表達或者突變。癌癥最重要的特征是細胞的惡性增殖, 而細胞增殖又需要細胞分裂周期基因(CDC)的參與[3]。若能夠尋找到具有特異性的抑制惡性細胞周期基因的抑制劑 ,那么癌細胞將無法進行增殖, 從而達到控制甚至治療癌癥的目的。細胞周期中必需的CDC25基因所表達的蛋白, CDC25磷酸酶是細胞周期調控蛋白 ,在正常的細胞周期中具有重要的作用。

哺乳動物中CDC25磷酸酶有3個型，分別是CDC25A、CDC25B、及CDC25C。

本試驗將通過CDC25A/CDC25B建立的高通量篩選模型進行體外酶抑制活性測定，篩選獲得活性藏藥材乙醇提取物[4]。在對CDC25磷酸酶的研究過程中 ,發現細胞CDC25A表達水平的失控會導致細胞周期的紊亂，降低 DNA 的穩定性，進而促進惡性腫瘤細胞的增殖[5]。已在肝癌、胰腺癌、胃癌等腫瘤中發現有 CDC25A 的高表達，并伴隨不良預后[6]。CDC25B屬短半衰期蛋白，與紡錘體形成有關，在DNA損傷后，作用于細胞恢復周期關鍵時期[7]。CDC25B的過量表達促進腫瘤生長和細胞的惡性轉化。CDC25B在人類肺癌、結腸癌、乳腺癌、前列腺癌中有較高表達[8-9]。因此，CDC25A/CDC25B成為公認的惡性腫瘤研究和治療的靶點之一[10]，本實驗利用基于重組表達的周期調節物可能對于癌癥治療是一個潛在的靶物質。因此，CDC25磷酸酶抑制劑的研制對于開發新的抗癌藥物具有極其重要的意義。

1 材料

單道可調型移液器(德國Brand)，多道可調型移液器(德國Brand)，POLARstar Omega全自動多功能酶標儀(德國BMG Labtech公司)，384孔酶標板(美國Corning)；蛋磷酸激酶CDC25A (人)活性熒光檢測試劑盒KA0083(臺灣Abnova)；蛋磷酸激酶CDC25B (人)活性熒光檢測試劑盒KA0083(臺灣Abnova)，其余試劑均為國產分析純試劑，試驗用水為超純水(自制)。采于青海境內48種藏藥材乙醇提取物，將全草用質量百分濃度65%～95%乙醇超聲提取1h，然后過濾并回流提取，合并提取所獲得浸膏，取0.4mg，溶解于100μL的DMSO中，超聲5min。再分別取1μL溶解樣品的DMSO，分別加入緩沖溶液99μL，得用于檢測抗CDC25磷酸酶待測物。

2 方法

2.1 反應原理 利用基于重組表達的CDC25A/CDC25B建立的高通量篩選模型進行體外酶抑制活性測定，篩選獲得活性乙醇提取物。

將反應體系于37℃條件下孵育20 min，之后加入CDC25A/CDC25B，同樣條件下繼續反應60 min，待反應完全，檢測在485 nm激發光作用下反應產物于520 nm處的熒光強度。酶活性存活率采用下列公式計算：酶活性存活率 = 實驗組測定值 / 對照組1測定值。其中酶活性存活率越低，說明測試樣品對組蛋白磷酸化酶CDC25A/CDC25B的抑制效果越強。

2.2 反應體系 抑制組蛋白磷酸激酶CDC25A/CDC25B活性測試實驗，設置三組反應，分別是實驗組、對照組1(加酶不加抑制分子)、對照組2(不加酶加抑制分子)。

實驗組反應在18 μL體系進行：2.7 μL 330 μmol/L FDP，1.8 μL 100 μmol/L測試物，2 μL 0.1 μmol/L CDC25A/CDC25B，11.5 μL FDP buffer。

對照組1反應在18 μL體系進行：

2.7 μL 330 μmol/L FDP，2 μL 0.1 μmol/L CDC25A/CDC25B，13.3 μL FDP buffer

對照組2反應在18 μL體系進行：2.7 μL 330 μmol/L FDP，1.8 μL 100 μmol/L測試物，13.5 μL FDP buffer。

3 結果

結果表明，11種藏藥材(防風、荊芥、雪層杜鵑、鎖陽、側金盞、斑花黃堇、黑頂黃堇、條裂黃堇、尼泊爾黃堇、粗梗黃堇及柳蘭)對CDC25A/CDC25B有明顯的抑制效果，均低于50%的抑制率；小葉紅景天和藍玉簪龍膽只對CDC25A有明顯的抑制效果，均低于50%的抑制率；甘青烏頭、四數獐牙菜、鐵線蓮、小花刺參及雪蓮只對CDC25B有明顯的抑制效果，均低于50%的抑制率。對照組1(加酶不加抑制分子)對CDC25A/CDC25B抑制率為100%，即無抑制作用，見表1。

表1 45種藏藥材提取物對CDC25A/B的抑制活性結果

*所得結果為3次試驗測得結果平均值。

4 討論

本試驗通過DC25A/CDC25B建立的高通量篩選模型進行體外酶抑制活性測定，篩選來自于15科32屬的45種藏藥材，其中小葉紅景天乙醇提取物對CDC25A磷酸酶有抑制活性。張敏等[11]紅景天提取物對體外培養肺癌細胞有明顯抑制作用，紅景天苷、紅景天加維甲酸能夠體外誘導腫瘤細胞凋亡[12,13]。除此之外，11種藏藥材(防風、荊芥、雪層杜鵑、鎖陽、側金盞、斑花黃堇、黑頂黃堇、條裂黃堇、尼泊爾黃堇、粗梗黃堇及柳蘭)對CDC25A和CDC25B磷酸酶有明顯的抑制效果。5種藏藥材(甘青烏頭、四數獐牙菜、鐵線蓮、小花刺參及雪蓮)只對CDC25B有明顯的抑制效果，除小葉紅景天外，上述有CDC25A/CDC25B磷酸酶抑制活性的均為首次報道。

通過對45種藏藥材乙醇提取物進行體外CDC25A/CDC25B磷酸酶抑制活性的初步篩，揭示這些藏藥材的抗腫瘤作用，同時為進一步開發利用藏藥材的抗腫瘤提供參考。

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