不同介質保存的遼寧絨山羊液態精液低溫（0℃）狀態下品質比較

王曉銘，劉興偉，郭 丹，吳 冰，朱延旭?

（1.遼寧省畜牧科學研究院，遼寧 遼陽 111000；2.遼寧省本溪市動物疫病預防控制中心，遼寧 本溪 117000）

遼寧絨山羊液態精液的保存時間對開展絨山羊人工授精具有重要的影響，保存時間延長，既可以延長精子有效存活時間，又可以進行長距離的輸精配種，從而提高液態精液的利用效率。通過查閱相關技術資料，絨山羊液態精液正常在0～4℃下保存[1]，可以達到延長精子存活時間的目的，而0℃是保存液態精液的溫度下限，與0℃以下的低溫保存存在哪些差異？另外，0℃又分為0℃的水和0℃的冰水混合物或0℃的冰等物理狀態，具體保存液態精液的效果如何？目前還沒有相關報導。因此，筆者于2016年秋季進行了在冰水混合狀態下遼寧絨山羊液態精液保存方法的試驗研究。

1 試驗材料

1.1 精液來源 試驗用精液為遼寧省遼寧絨山羊科技示范場飼養的一級種用公羊的混合精液，混合后精液的平均活力達70%[2]。

1.2 精液保存溫度環境的獲取方法

1.2.1 0℃冰水混合物 在冰箱中通過制冷凍成冰水混合物，然后將冰塊壓成碎塊，將超低溫溫度儀的觸頭插入碎冰中，測得實際溫度，如果冰的溫度低于0℃，則攪動冰水混合物，使之達到0℃，冰水混合物達到0℃后，冰與水按4:1混后取150 mL，備用。

1.2.2 0℃的冰 將1.2.1中制成的冰水混合物撈出150 mL，備用。

1.2.3 0℃的水 將1.2.1中制成的冰水混合物的水取出150 mL，備用。

1.2.4 3～5℃的低溫水的制取 在將冰箱保鮮層的溫度調節到3～5℃，然后以適當的窗口裝入一定量的水，在保鮮層內降溫，當用溫度計測得水的溫度降到3～5℃時即3～5℃的低溫水的制取成功，取出150 mL，備用。

2 試驗方法

2.1 精液采集 公羊精液合格后，即進入試驗準備期，共5 d時間，采精3次，測定不同時間階段精子活力的變化規律，由此確定，試驗開始時每3 h測定精子活力，當精液保存至第3天后，每2 h測定活力1次，直至精子活力為0[3]。

2.2 精子活力的評定方法 采用肉眼在150～600倍光學顯微鏡下觀察，并結合“羊精子全自動分析系統”測定，對試驗公羊的精子活力進行評定，觀測羊精子的環境溫度為37℃[4]。

2.3 精液稀釋液的配制 用電子天平稱取乳糖、葡萄糖、檸檬酸鈉、EDTA、Tris等分析純藥劑，加入雙次蒸餾水，煮沸降溫后再加入卵黃及抗菌素，配制成遼寧絨山羊液態精液稀釋液[5]。

2.4 精子頂體完整率的評定方法 精子快速染色液染色，取少量稀釋精液抹片，用95%乙醇鋪滿載玻片固定2～3 min，空氣中自然晾干[6]，干透后水合1～2 min，倒凈液體。滴加試劑一（細胞核染液）鋪滿載玻片染色30 s～2 min，流水洗凈倒凈液體。試劑二（細胞質染液）鋪滿載玻片染色20 s～2 min，不要倒丟，立即滴加若干滴增色夜混合作用5 s左右，再用試劑三（增色液）充分沖洗一遍，濾紙吸干。利用精子分析儀分析。隨機選取200個精子，觀察頂體，標記頂體不完整的精子。頂體完整率=（200-頂體不完整精子數/200）×100%。

3 結果與分析

3.1 遼寧絨山羊液態精液最佳保存介質的確定試驗分為A、B、C、D四組，其中A、B、C為試驗組，D為對照組。A組為0℃冰，B組為0℃冰水混合物，C組為0℃水，D組為3～5℃的低溫水，為保持溫度不明顯波動，每12 h更換一次冰、水或冰水混合物，放入精液后，置于4～5℃的恒溫冰箱中，精液與稀釋液1:1混合，跟蹤對照稀釋后的精液的低溫存活時間、活力50%時回溫38℃存活時間、活力≥0%時存活時間及頂體完整率的變化情況如表1所示。

表1 稀釋后精液在四種介質中的活力與存活時間對比Table 1 Comparison of the vitality and survival time of diluted semen in four mediums

由表1可知，活力≥50%存活時間和活力≥0%存活時間，以B組最高，A組次之，C最再次之，D組最低，但A、B、C三組間差異不顯著（P＞0.05）；A、B、C三組與D組比較，差異極顯著（P＜0.01）。活力50%時回溫38℃存活時間，以B組最高，C組次之，A組再次之，但A、B、C三組相互間差異不顯著（P＞0.05）；A、B、C三組與D組比較，差異顯著（P＜0.05）。頂體完整率A、B、C、D各組差異不顯著（P＞0.05）。由此結果可以初步判定，B組0℃冰水混合物是保存液態遼寧絨山羊精液的最佳介質。

3.2 以 00℃冰水混合物為保存介質液態精液最佳稀釋比例的研究 根據前面的研究結論，以0℃冰水混合物為遼寧絨山羊液態精液的保存介質。分別設立A、B、C、D四組，精液與稀釋液的比例分別為1:1、1:2、1:3、1:4，并跟蹤觀察稀釋后的精液的低溫存活時間、活力50%時回溫38℃存活時間、活力≥0%時存活時間及頂體完整率的變化情況，結果如表2所示。

由表2可知，活力≥50%存活時間，以B組最高，D組次之，C組再次之，但B、C、D三組間差異不顯著（P＞0.05）。活力≥0%存活時間，以B組最高，C組次之，D組再次之，但B、C、D三組間差異不顯著（P＞0.05）。活力50%時回溫38℃存活時間，以B組最高，D組次之，C組再次之，但B、C、D三組間差異不顯著（P＞0.05）；B、C、D三組與A組比較，差異顯著（P＜0.05）。頂體完整率A、B、C、D各組差異不顯著（P＞0.05）。

表2 以0℃冰水混合物為保存介質不同稀釋比例的對比Table 2 Comparison of different dilution ratios at 0℃ice water mixture as storage medium

4 討論

4.1 筆者在設計試驗時，對精液的稀釋比例以1:1、1:2、1:3、1:4作為各不相同的試驗條件，主要是考慮到精液的稀釋比例不同時，會引起稀釋液成份濃度在稀釋后的精液中的濃度不同，從而引起精子對溫度的降低的適應能力不同，最終引起精子結構的損壞程度可能不同，但是由于試驗條件的限制，沒有對其他比例的稀釋精液進行試驗，需以后做其他試驗加以完善。

4.2 0℃冰、0℃冰水混合物、0℃水的試驗效果均優于3～5℃的低溫水，說明0℃以上的環境下，精子仍存在能量消耗，為驗證這一結論，筆者觀察了3～5℃條件下精子的運動狀態。具體方法是將光學顯微鏡和精液置于3～5℃的低溫平衡柜內，待溫度穩定后對精子進行觀察，發現低溫下精子仍有擺動、顫動和小量的前進運動，據此推測，精子運動消耗能量，同時精子代謝仍在進行，如果精子保存時間較長，精子代謝和運動的能量消耗是不可忽視的。

4.3 由于冰水混合物與0℃冰、0℃水比較，具有溫度穩定、吸熱量多、制取及控溫容易等優點，因此，可作為生產實踐中精液降溫的推廣方法。

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4.4 本試驗比較了部分的精液技術指標，而精子的質膜完整性、畸形率、代謝產物的變化、輸精受胎率等指標沒有進行相關試驗進行驗證，只是對人工授精技術環節的研究起到了一定的拋磚引玉的作用，有待于今后開展更為系統深入的研究。

[1] 劉興偉，陳寧.絨山羊液態精液稀釋技術[J].黑龍江動物繁殖，2016，24（2）：29-31.

[2] 張世偉，楊術環，宋先忱，等.絨山羊飼養管理技術規程（NY/T2893-2016）[S].

[3] 楊術環，宋先忱，王世泉，等.遼寧絨山羊人工授精技術操作規程（DB21/T 24342015）[S].

[4] 張世偉，等.遼寧絨山羊生產實用技術[M].呼和浩特：內蒙古出版社，2003.

[5] 傅文棟，王新平.家畜精液品質評定項目及其方法[J]. 新疆畜牧業，2010，12：53-55.

[6] 張世偉，宋先忱，朱延旭，等.遼寧絨山羊細管冷凍精液研究[J]. 中國畜牧雜志，2006，42（3）：23-25.