不同濃度半胱氨酸對幼齡陶寒雜種羊卵母細(xì)胞發(fā)育的影響

羅惠娣，毛楊毅，周勝花，郭慧慧，李春艷，李 希，張 麗，吳蘇君，薛麗娜，黨文慶

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032）

科學(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)，在自然狀態(tài)下，胎兒卵巢上的有腔卵泡出現(xiàn)在大約母羊妊娠期的135 h，出生之后有腔卵泡數(shù)量隨著日齡的增加而增加，4～8周齡達(dá)到高峰；以后隨著性成熟的到來逐漸減少，直至33周齡后保持恒定。4～8周幼齡羊的卵巢對生殖激素非常敏感，卵泡發(fā)育很少發(fā)生閉鎖，若此階段采用促性腺激素誘導(dǎo)技術(shù)，平均獲得可用卵母細(xì)胞80枚/只左右，因此，這是一條高效率獲得卵母細(xì)胞的有效途徑。

隨著胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)的不斷完善，采用促性腺激素誘導(dǎo)幼齡羊獲得的大量卵母細(xì)胞，在體外成熟、受精和受精卵發(fā)育培養(yǎng)，獲得體外生產(chǎn)的胚胎[1-9]，再將其移植后已生產(chǎn)出“試管羊”[10-15]。但在幼齡羊胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)體系中，一直存在幼齡羊卵母細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育能力差[16-18]及卵母細(xì)胞成熟不充分的問題。為此，研究者模仿體內(nèi)卵母細(xì)胞成熟環(huán)境條件，在成熟液力添加促性腺激素（FSH，LH）和雌二醇、生長因子（IGF-1，F(xiàn)GF，EGF）、血清、能量物質(zhì)、抗氧化劑等物質(zhì)，試圖通過改進(jìn)成熟液，達(dá)到提高幼齡羊卵母細(xì)胞發(fā)育能力。曹忻等[19]進(jìn)行了血管內(nèi)皮生長因子對體外成熟綿羊卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化影響的研究；郭洪等[20]進(jìn)行EGF和β-巰基乙醇對羔羊卵母細(xì)胞體外受精和體外發(fā)育影響的研究；韓巖等[21]進(jìn)行谷胱甘肽對卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育影響的研究。但迄今為止，未見添加不同濃度半胱氨酸的成熟液對幼齡綿羊卵母細(xì)胞發(fā)育影響的研究報(bào)道。本試驗(yàn)進(jìn)行了成熟液中添加不同濃度半胱氨酸對幼齡陶寒雜種羔羊卵母細(xì)胞發(fā)育影響的研究，為優(yōu)化幼齡羊胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)羊 9只4～8周齡陶寒雜種羔羊由太原青蓮養(yǎng)殖有限公司提供，陶賽特公羊由山西科元?jiǎng)游锱咛スこ讨行奶峁?/p>

1.1.2 凍精和發(fā)情羊血清（ESS） 陶賽特公羊顆粒凍精和ESS由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物遺傳工程實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.3 主要激素、試劑及耗材 促卵泡素（FSH）、孕馬血清（PMSG）、促黃體素（LH）、17β-雌二醇（17β-E2），均購自北京綠欣農(nóng)牧科技有限公司，前列腺素（PG）購自寧波激素廠。

TCM199、肝素鈉、半胱氨酸、必需氨基酸（EAA）、非必需氨基酸（NEAA）、牛血清白蛋白（BSA）等生物試劑和KH2PO4、NaHCO3、CaCl2等化學(xué)試劑，均購自sigma公司。

培養(yǎng)皿、PE管、試管等購自Corning公司，四孔培養(yǎng)板購自Nunc公司。

1.1.4 主要儀器、手術(shù)器械及用品 超凈工作臺（SWCJ-2FD）、體視顯微系統(tǒng)（OLYMPUS SZX10）、二氧化碳培養(yǎng)箱（SANYO MCO-5AC）、研究級倒置顯微系統(tǒng)（OLYMPUS IX71）等，均由山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物遺傳工程實(shí)驗(yàn)室提供。

手術(shù)剪、手術(shù)刀、持針器、止血鉗、碘酒、75%酒精、注射器等，均購自山西省醫(yī)療器材公司。

1.1.5 培養(yǎng)液 采卵液：M199+20 mmol/L Hepes+2%ESS+10 mg/mL肝素鈉；對照成熟液：M199+20%ESS+10 μg/mL FSH+10 μg/mL LH+1 μg/mL 17β-E2；試驗(yàn)成熟液Ⅰ：對照成熟液+100 μmol/L半胱氨酸；試驗(yàn)成熟液Ⅱ：對照成熟液+150 μmol/L半胱氨酸；試驗(yàn)成熟液Ⅲ：對照成熟液+200 μmol/L半胱氨酸；精子獲能液：SOF+20 μg/mL肝素鈉；受精液：SOF+2%ESS；受精卵發(fā)育液：SOF+8 mg/mL BSA+2%EAA+1%NEAA。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 4～8周齡羔羊激素誘導(dǎo) 采用Kelly等[4]促性腺激素誘導(dǎo)方法，與其不同的是PMSG注射量為300～350 IU/只。

1.2.2 ESS制備 頸靜脈采取發(fā)情羊血液，按常規(guī)方法制備血清。

1.2.3 顆粒凍精制作 將活力0.8以上陶賽特公羊精液采用常規(guī)干冰冷凍法制作顆粒凍精。

1.2.4 精子體外獲能 采用白佳樺[10]報(bào)道的精子體外獲能方法。

1.2.5 卵母細(xì)胞采集 采用白佳樺[10]羔羊活體采集卵母細(xì)胞的方法。

1.2.6 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng) 采用白佳樺[10]卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的方法。不同之處是將采集的4～8周齡陶寒雜種羔羊的A、B級卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）隨機(jī)分為相等4份，分別放在5%CO2（38.5℃、飽和濕度）培養(yǎng)箱中含不同濃度半胱氨酸（0、100、150、200 μmol/L）的四孔培養(yǎng)板孔成熟液里培養(yǎng)24 h。

1.2.7 卵母細(xì)胞體外受精及受精卵培養(yǎng) 采用白佳樺[10]的卵母細(xì)胞體外受精和受精卵培養(yǎng)的方法。受精卵培養(yǎng)20 h左右，在顯微鏡下觀察卵裂情況并統(tǒng)計(jì)卵裂率，繼續(xù)培養(yǎng)4～5 d，觀察受精卵發(fā)育情況并統(tǒng)計(jì)桑葚胚率或囊胚率。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用EXCEL計(jì)算和X2檢驗(yàn)的方法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4～8周齡陶寒雜種羔羊超排效果 試驗(yàn)超排的4～8周齡陶寒雜種羔羊卵巢及卵巢上卵泡發(fā)育情況見圖1。

圖1 超排后卵巢上卵泡Fig.1 An ovary and its upper follicle after superovulation

激素誘導(dǎo)的9只4～8周齡陶寒雜種羔羊，其中8只卵巢體積增大，紅漲，上面密布充滿卵泡液的卵泡，共采集A、B級COCs 624枚，平均78枚/只；1只羔羊卵巢未發(fā)育，即4～8周齡陶寒雜種羔羊超排有效率為88.89%。

2.2 不同濃度半胱氨酸成熟液對卵母細(xì)胞發(fā)育的影響 624枚A、B級卵母細(xì)胞在不同濃度半胱氨酸成熟液里成熟后，經(jīng)體外受精孵育和受精卵發(fā)育培養(yǎng)后，卵母細(xì)胞的發(fā)育情況見表1和圖2～3。

由表1可知，試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組成熟液里成熟的卵母細(xì)胞卵裂率分別比對照組高1.28、3.2和4.48個(gè)百分點(diǎn)（P＞0.05），囊胚率分別比對照組高3.2、4.49和5.13個(gè)百分點(diǎn)（P＞0.05），且成熟液含半胱氨酸在200 μmol/L以內(nèi)，卵母細(xì)胞的卵裂率和囊胚率呈上升趨勢。

圖2 體外受精的2～4細(xì)胞受精卵Fig.2 2～4 cell fertilized ovum

表1 不同濃度半胱氨酸成熟液中卵母細(xì)胞發(fā)育情況Table 1 Developmental conditions of oocyte in the maturation liquid with different concentrations of cysteine

圖3 體外受精的囊胚Fig.3 Blastocyst

3 討論

卵母細(xì)胞成熟液是幼齡羊胚胎體外生產(chǎn)培養(yǎng)體系的重要組成部分，卵母細(xì)胞能否成熟充分直接關(guān)系到繼續(xù)發(fā)育的能力，直接影響幼齡羊胚胎體外生產(chǎn)效率。在幼齡羊體外成熟液的研究方面，Bai J H等[16]研究成熟液含100 μmol/Lβ-巰基乙醇和600 μmol/L半胱氨酸對性成熟前蒙古羊卵母細(xì)胞發(fā)育的影響，受精率和囊胚率分別為86.90%和23.90%，比對照組67.90%和14.9%提高19和9個(gè)百分點(diǎn)；郭洪等[20]研究體外成熟液添加50～200 μmol/L β-巰基乙醇對4～8周齡綿羔羊卵母細(xì)胞發(fā)育的影響，卵裂率為68.20%比對照組64.20%提高2個(gè)百分點(diǎn)。本試驗(yàn)進(jìn)行不同濃度半胱氨酸成熟液對幼齡陶寒雜種羔羊卵母細(xì)胞發(fā)育影響的研究，添加100、150、200 μmol/L半胱氨酸的試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組的卵裂率分別為60.90%、62.82%、64.10%，比對照組59.62%分別高1.28、3.2、4.48個(gè)百分點(diǎn)（P＞0.05），囊胚率分別為21.79%、23.08%、23.72%，比對照組18.59%分別高3.2、4.49、5.13個(gè)百分點(diǎn)（P＞0.05），且成熟液含半胱氨酸在200 μmol/L以內(nèi)，卵母細(xì)胞的卵裂率和囊胚率呈上升趨勢，本試驗(yàn)結(jié)果與Bai J H等[16]和郭洪等[20]研究結(jié)果相一致。由于半胱氨酸是合成谷胱甘肽（GSH）的底物。GSH是一種含γ-酰胺鍵和巰基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，半胱氨酸上的巰基為其活性基團(tuán)。GSH存在于身體的正常細(xì)胞中，具有抗氧化和解毒作用。在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中，它通過自由巰醇基團(tuán)（-SH）保護(hù)卵母細(xì)胞發(fā)育過程中所需功能蛋白質(zhì)、酶不被氧化，消除活性氧自由基（ROS）對卵母細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育的阻滯或延遲作用，使卵母細(xì)胞得到充分成熟，加速受精卵中精子解聚和原核形成，減少卵母細(xì)胞孤雌激活和多精子受精的發(fā)生，增加正常卵母細(xì)胞受精的比例和受精卵發(fā)育能力。

4 結(jié)論

在卵母細(xì)胞成熟液里添加一定量半胱氨酸能夠促進(jìn)幼齡陶寒雜種羔羊卵母細(xì)胞的成熟，提高體外生產(chǎn)胚胎的質(zhì)量和效率。成熟液里含半胱氨酸在200 μmol/L以內(nèi)，隨著半胱氨酸濃度增加，卵母細(xì)胞體外受精后卵裂率和囊胚率呈上升趨勢，因此，成熟液里最佳半胱氨酸濃度，有待進(jìn)一步研究。

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