雞傳染性法氏囊病病毒RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

李繼娟，張 敏

（河南省焦作市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 焦作 454003）

雞傳染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是由法氏囊病毒（IBDV）引起的一種免疫抑制性傳染病，主要表現(xiàn)為急性、熱性、高度接觸性[1]。該病可引起感染雞群較高的死亡率，IBDV的早期感染會(huì)引起長期、嚴(yán)重的免疫抑制[2]，也會(huì)引起壞死性皮炎、包涵體肝炎、貧血綜合征和大腸埃希菌感染的并發(fā)或繼發(fā)感染[3-7]，從而引起其他疾病的免疫失敗[8-9]。防控該病的主要措施是免疫接種[10]。近年來，IBDV在臨床發(fā)病呈現(xiàn)出新的特點(diǎn)勢[11-13]，一年四季均可發(fā)病，病變呈現(xiàn)非典型性，臨床無明顯發(fā)病癥狀，發(fā)病率較高，死亡率較低。同時(shí)由于疫苗的使用、免疫程序的混亂、環(huán)境污染嚴(yán)重，使得IBDV的毒力和抗原均發(fā)生了變異，給診斷和防治帶來了一定的困難[14-16]。因此，加強(qiáng)IBDV診斷技術(shù)和分子流行病學(xué)監(jiān)測方法的研究，對防控IBD有重要的意義，建立快速、敏感、特異的診斷方法是有效防控該病的關(guān)鍵。

本研究選取IBDV的高度保守序列，建立IBDV的RT-PCR檢測分子診斷方法，旨在為IBDV的分子診斷提供一種快速、準(zhǔn)確的檢測方法，為IBDV流行病學(xué)的調(diào)查研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試病料 法氏囊病病毒（IBDV）、新城疫病毒（NDV）、雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、馬立克病病毒（MDV）、禽流感病毒（AIV），均由實(shí)驗(yàn)室分離保存。Taq酶、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄酶，氯化鎂，限制性內(nèi)切酶、RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等，購自大連寶生物股份工程有限公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中發(fā)表的IBDV SH95毒株A片段mRNA序列，選取IBDV的保守區(qū)序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由上海生物工程有限公司合成引物。上游引物5’-GGTATGTGAGGCTTGGTGAC-3’，下游引物5’-GATCCTGTTGCCACTCTTTC-3’。

1.3 病毒基因組RRNNAA的提取及ccDDNNAA的合成 采用柱式法提取RNA，按照試劑盒操作步驟提取。取RNA 2 μL反轉(zhuǎn)錄成cDNA保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RTT--PPCCRR反應(yīng)條件的篩選及優(yōu)化

1.4.1 模板用量的確定分別以2、4、6、8、10 μL RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

1.4.2 引物濃度反應(yīng)體系為25 μL，分別加入2、4、6、8、10 和 12 μL（20 μmol/μL）引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

1.4.3 退火溫度的確定，分別取52、53、54、55、56和57℃作為PCR反應(yīng)的退火溫度。

1.5 擴(kuò)增及產(chǎn)物鑒定 反應(yīng)體系為25 μL，根據(jù)反應(yīng)條件篩選及優(yōu)化條件，模板用量為4 μL，引物用量為2 μL，退火溫度為 55 ℃，Taq（5 U/μL）0.5 μL，10×Ex Taq Buffer 12 μL，dNTP（2.5 mmol/L）3 μL，引物（20 μmol/μL）各 2 μL，cDNA 5 μL，加DEPC水至50 μL。PCR反應(yīng)條件是：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性2 min，57℃退火1 min，72℃延伸3 min，3個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與Loading Buffer混勻，l%瓊脂糖凝膠電泳，以DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL 2000）做參考，120 V電壓條件下電泳，結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照分析。根據(jù)電泳結(jié)果對擴(kuò)增產(chǎn)物的大小進(jìn)行初步鑒定。用膠回收試劑盒回收目的片段。將回收產(chǎn)物進(jìn)行克隆與轉(zhuǎn)化。挑取出白色的菌落，采取α互補(bǔ)法對其質(zhì)粒進(jìn)行初步篩選，之后按質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行提取。將陽性克隆送至大連寶生物有限公司進(jìn)行測序鑒定并進(jìn)行比對分析。

1.6 特異性試驗(yàn) 分別用IBDV、ILTV、NDV、MDV、AIV的基因組DNA或RNA，按照上述方法進(jìn)行擴(kuò)增。

1.7 PPCCRR敏感性試驗(yàn) 將RNA定量，并依次10倍稀釋，使其為 1 μg RNA，0.1 μg RNA，10 pg RNA，10-1pg RNA， 10-2pg RNA， 10-3pg RNA， 10-4pg RNA，10-5pg RNA，10-6pg RNA，10-7pg RNA，10-8pg RNA，10-9pg RNA。分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.8 PPCCRR重復(fù)性試驗(yàn) 用優(yōu)化后的方法對病料進(jìn)行重復(fù)性檢測，判斷其重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.9 臨床應(yīng)用 利用上述建立的檢測方法對臨床病料進(jìn)行檢測與鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 RRTT--PPRR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

2.1.1 凝膠檢測擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的凝膠進(jìn)行電泳，如圖1所示，目的條帶為610 bp，與預(yù)期大小相條帶一致。

2.1.2 酶切鑒定用凝膠回收試劑盒回收目的條帶，與克隆載體連接克隆，然后酶切鑒定，可見目的條帶，說明克隆載體構(gòu)建成功。

圖 1RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT-PCR amplification result

2.1.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的測序鑒定挑取EcoRⅠ和HindⅢ雙切酶鑒定正確的陽性菌液進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，與IBDV序列一致。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果 應(yīng)用建立的方法對樣本進(jìn)行擴(kuò)增，法氏囊病病毒擴(kuò)增出了610 bp的目的片段，而其他樣品均未擴(kuò)增出條帶，說明本方法特異性較好（圖2）。

2.3 敏感性試驗(yàn) 從圖3可以看出，靈敏度可達(dá)10 pg RNA。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 用建立的方法對樣本進(jìn)行重復(fù)性檢測，結(jié)果完全一致，具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.5 臨床應(yīng)用 應(yīng)用上述建立的方法對臨床樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，檢出陽性樣品6份（圖4），將陽性樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序后比對均為IBDV。

圖2 RT-PCR特異性試驗(yàn)Fig.2 RT-PCR specificity test

圖3 PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 PCR sensitivity test results

圖4 臨床樣品的檢測結(jié)果Fig.4 Detection results of clinical samples

3 結(jié)論與討論

雞傳染性法氏囊病病毒主要侵害3～12周齡雛雞以及青年雞，對雞的法氏囊器官起到侵害作用，從而導(dǎo)致雞的免疫抑制，降低機(jī)體對其他致病因子如新城疫、球蟲病等的抵抗力[18-21]。因此，應(yīng)該加強(qiáng)對本病的檢測，對養(yǎng)雞較集中的地區(qū)，要定期抽樣檢測雞傳染性法氏囊病病毒的感染情況，及時(shí)淘汰感染雞群，降低發(fā)病率。自20世紀(jì)80年代以來，由于疫苗的大量應(yīng)用，病毒的毒力及抗原發(fā)生變異，傳染性法氏囊病在臨床癥狀、病理變化及常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)很難檢測出來[22-28]。另外，IBD所引起的細(xì)菌繼發(fā)性感染或者與其他病毒的混合感染較為普遍，臨床表現(xiàn)也更復(fù)雜多樣[29-30]。為了避免該RTPCR檢測方法出現(xiàn)假陽性結(jié)果，應(yīng)該結(jié)合臨床癥狀、組織病變和流行病學(xué)等手段進(jìn)行綜合診斷。相對于我國目前常用的雞傳染性法氏囊病檢測技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、間接免疫熒光、原位雜交、免疫組織化學(xué)等，RT-PCR檢測具有快速、敏感、準(zhǔn)確、特異性等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，有很多因素會(huì)影響到RT-PCR的檢測結(jié)果，本研究針對RT-PCR反應(yīng)的條件進(jìn)行了篩選與優(yōu)化。

本研究建立的RT-PCR檢測方法，該方法僅對IBDV能擴(kuò)增出610 bp的特異性片段，而對ILTV、NDV、MDV和AIV的檢測結(jié)果均為陰性，說明其具有良好的特異性。此外，本試驗(yàn)通過反轉(zhuǎn)錄、RT-PCR擴(kuò)增兩步法獲得較為滿意的擴(kuò)增結(jié)果，所需時(shí)間較短，操作程序較為簡便，價(jià)格較為低廉，為IBD的診斷和流行病學(xué)的研究提供了一種簡便有效的方法。

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