李麒峰，徐寶山，楊強，馬信龍，張楊，郭悅，楊陽，張凱輝，夏金健，張維昊

椎間盤退變引起的腰腿痛是常見病，嚴重影響人們健康和工作生活，癥狀嚴重者常需手術治療，每年都會造成巨額醫(yī)療費用和社會負擔［1-2］。目前主要治療方法是椎間盤髓核摘除手術，然而手術只能緩解癥狀，剩余的不完整椎間盤不能再生，繼發(fā)退變加重，甚至導致突出復發(fā)，因此探索合適的椎間盤再生修復措施越來越受到關注［3］。隨著組織工程技術的不斷發(fā)展，組織工程椎間盤構建為恢復椎間盤天然結構和生物功能提供了可能，關鍵因素是選擇理想的支架和種子細胞。聚己內(nèi)酯（PCL）是一種高分子聚合材料，具有很高的強度和良好彈性，廣泛應用于血管、肌腱、軟骨、骨等生物醫(yī)學材料領域［4］。海藻酸鈉/殼聚糖混合得到的是一種無毒無害、生物相容性良好的注射性水凝膠，已廣泛地應用于生物醫(yī)學領域［5］。種子細胞方面，由于椎間盤是纖維軟骨樣組織，且自體椎間盤細胞來源有限，目前多采用多功能干細胞作為種子細胞，人臍帶沃頓膠來源的間充質(zhì)干細胞（hWJ-MSCs）對供者無損傷，來源充足、免疫原性低、干細胞含量豐富、體外擴增能力強，具有自然向類軟骨細胞分化的特點，可作為種子細胞用于椎間盤組織工程的研究［6］。本研究應用熔融紡絲法以聚己內(nèi)酯為材料構建取向性多孔組織工程纖維環(huán)支架，在其中間注射水凝膠得到雙相支架，復合人臍帶間充質(zhì)干細胞，通過組織學觀察、生物相容性研究及力學分析，評價構建方法的可行性，為構建椎間盤提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料 （1）實驗組織。經(jīng)由天津醫(yī)院婦產(chǎn)科行剖宮產(chǎn)手術產(chǎn)婦同意，獲得新鮮無污染人臍帶5段，用于臍帶沃頓膠的取材。（2）主要試劑、儀器。聚己內(nèi)酯顆粒（Sigma-Aldrich，美國）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco，美國）；死活細胞（Live/Dead）染色試劑（Abcam，英國）；CCK-8細胞檢測試劑盒（DOJINDO，日本）；海藻酸鈉（化學純，青島雙成海藻有限公司）；殼聚糖（食用級，青島博智匯力生物科技有限公司）；掃描電子顯微鏡（SEM，Hitachi，日本）；激光共聚焦顯微鏡（Leica，TCS，德國）；酶標儀（iMark，Bio Rad，日本）；體式顯微鏡（Leica，S8APO，德國）；冷凍干燥機（CHRIST，德國）等。

1.2 椎間盤雙相支架的制備 （1）纖維環(huán)（AF）支架的制備：參考文獻［7］采用電加熱熔融紡絲裝置制備纖維管，見圖1A，再經(jīng)80℃加熱器加熱5 s，絲與絲間形成焊點，使纖維管更牢固，達到理想的力學特性，然后再經(jīng)切割器將纖維管切成5 mm長的纖維環(huán)，留用實驗。（2）髓核（NP）支架的制備：參考文獻［8］制得氧化海藻酸鈉/羥丙基殼聚糖水凝膠，注入到纖維環(huán)相中央，放在37℃恒溫箱成膠30 min，得到雙相支架，見圖1B，留作實驗備用。

Fig.1 Preparation of intervertebral disc biphasic scaffolds圖1 椎間盤雙相支架的制備

1.3組織工程椎間盤的構建 （1）臍帶間充質(zhì)干細胞的分離與培養(yǎng)。將無菌新鮮的臍帶導入換藥碗中，倒入生理鹽水沖洗2次，盡量洗凈血液，用剪刀將臍帶剪成若干段，剖開一側臍帶外膜，剔除血管，慢慢剪下沃頓膠放于瓶皿中，并用刀片切成2 mm×2 mm的小塊，Hank’s液漂洗2遍。用0.2%Ⅱ型膠原酶于37℃搖床200 r/min消化2h，利用200目鋼網(wǎng)過濾，1 500 r/min離心10 min，棄掉一半上清，再加Hank’s液，離心10 min，所得的細胞沉淀用培養(yǎng)液稀釋后，接種到培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3d換液。培養(yǎng)至P2代細胞待用，見圖2。（2）無菌的雙相支架浸泡培養(yǎng)液過夜。用槍頭吸干培養(yǎng)液，將消化獲得的P2代臍帶間充質(zhì)干細胞接種到雙相支架，然后將其置于培養(yǎng)箱孵育2h，使細胞貼壁，移至48孔板中加入DMEM培養(yǎng)液（20%胎牛血清）培養(yǎng)，每天換液［9］。

Fig.2 P2 generation of umbilical cord mesenchymal stem cells圖2 P2代臍帶間充質(zhì)干細胞

1.4 椎間盤雙相支架的性能評估

1.4.1 大體觀察 于體式顯微鏡下觀察雙相支架并照相記錄。

1.4.2 掃描電鏡觀察 將支架切割成厚5 mm、寬6 mm環(huán)狀結構，抽真空，表面噴金處理后，于掃描電鏡下拍照。

1.4.3 支架孔徑、孔隙率測定 孔徑：取多個掃描電鏡拍照記錄的樣品圖片，每個樣品隨機讀取不同位置圖片，分別測量多組不同孔的直徑，用于計算雙相支架孔徑。孔隙率：將樣品置入盛有乙醇的刻度量筒中，浸泡4h取出樣品，記錄此過程中量筒內(nèi)的體積變化值。根據(jù)公式ε=（V1-V3）/（V2-V3）×100%，V1為未浸入樣品的體積，V2為浸入樣品的體積，V3為取出樣品后的體積，測量5次，取均值。

1.4.4 材料生物相容性檢測 電鏡觀察：細胞-支架復合物培養(yǎng)7d后，用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，干燥噴金，掃描電鏡觀察。死活細胞染色觀察：復合物培養(yǎng)7d后，吸除培養(yǎng)液，PBS漂洗2遍，加入死活細胞染液，37℃培養(yǎng)箱孵育30 min，避光后共聚焦顯微鏡下觀察。細胞增殖能力分析（CCK-8檢測）：復合物分別培養(yǎng)至第1、3、5、7天后，加入50 μL CCK-8試劑（相當于10%培養(yǎng)液量），37℃培養(yǎng)箱孵育4h，避光后酶標儀檢測不同時段光密度（OD）值。

1.4.5 雙相支架力學性能測試 參考文獻［10］進行雙相支架力學測試，繪制載荷位移曲線，計算壓縮彈性模量。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 雙相支架形態(tài)及掃描電鏡觀察 顯微鏡下觀察見纖維環(huán)相成規(guī)則多孔結構，髓核相透明均勻，兩者粘連緊密，見圖3A、B。掃描電鏡下可見纖維環(huán)相呈多孔的菱形結構，孔間疊加緊密，髓核相呈多孔結構，見圖3C、D。

Fig.3 Structure of intervertebral disc biphasic scaffolds圖3 椎間盤雙相支架的結構

2.2 支架孔徑、孔隙率測定結果 纖維環(huán)支架孔徑為（225.6±3.9）μm，孔隙率為（74.17±0.39）%；髓核支架孔徑（205.5±5.2）μm，孔隙率為（85.52±0.48）%。

2.3 生物相容性檢測結果 掃描電鏡顯示細胞黏附在支架的不同層面，見圖4A、B；死活細胞染色可見在雙相支架上細胞活性良好，見圖4C、D；CCK-8增殖實驗分析結果顯示，纖維環(huán)相和髓核相細胞在不同培養(yǎng)時間OD值比較差異有統(tǒng)計學意義（F分別為111.66和58.63，P＜0.01），提示人臍帶干細胞在雙相支架有良好的增殖活性，見圖5。

2.4 雙相支架的力學性能測定結果 繪得載荷-位移曲線見圖6，壓縮彈性模量為（173.24±44.93）kPa。

3 討論

Fig.4 SEM images and live/dead cell staining of complexes after culturing for 7 days圖4 復合物培養(yǎng)7d后掃描電鏡和死活細胞染色圖

Fig.5 Cell metabolic activity curve圖5 細胞增殖活性曲線

Fig.6 Load-displacement curve圖6 載荷-位移曲線

椎間盤是由位于中央的髓核，外側的纖維環(huán)以及上下兩側的軟骨終板組成。髓核是高度水合的凝膠狀組織，其主要成分是水、具有多分散的帶負電的蛋白聚糖和多種膠原和非膠原蛋白［11］。纖維環(huán)由高度取向的膠原纖維（主要是Ⅰ型膠原）組成交替取向的片層，相互間成角±30°，抵抗中心髓核加壓以及彎曲延伸和側向彎曲過程中產(chǎn)生的高拉伸應力［12］。這種特殊斜交疊層結構賦予纖維環(huán)限制髓核突出、承受復雜應力的功能，使椎間盤能夠有效緩沖震蕩、分散負荷［13］，組織工程椎間盤應該具備這些結構特點。因此應用組織工程策略仿造天然椎間盤的生理結構是當前研究的方向。以前期本課題組實驗方法為基礎，本研究用聚己內(nèi)酯/殼聚糖/海藻酸鈉為材料，采用熔融紡絲法和成膠法，仿造天然椎間盤結構和生物力學構建組織工程椎間盤雙相支架，并復合人臍帶干細胞驗證其生物特性。

理想的組織工程椎間盤支架應具備合適的孔徑、高孔隙率和相連的多孔形態(tài)、良好的生物兼容性、適宜的生物降解吸收性、高表面積的三維結構、與植入部位相匹配的力學強度［14］。本研究制得的組織工程椎間盤雙相支架，孔徑大小適中、孔隙率高，掃描電鏡觀察可見纖維環(huán)相絲間成角60°的規(guī)則多孔結構，髓核相的成多孔形態(tài)，并且有三維結構，這些均符合組織工程椎間盤結構特性。椎間盤雙相支架通過壓縮測試，測得壓縮彈性模量為（173.24±44.93）kPa，其力學特性要優(yōu)于靜電紡絲、濕法紡絲等紡絲支架，雖然其壓縮彈性模量低于人正常椎間盤（238.7±68.0）kPa，但是隨著體內(nèi)長期力學刺激、細胞增多、膠原蛋白的分泌，其壓縮應力會達到正常椎間盤的要求［15］。

本研究中，雙相支架細胞復合體體外培養(yǎng)7d后，掃描電鏡顯示人臍帶干細胞成梭形或球形分布在支架表面，提示其對種子細胞生長分泌有利。CCK-8增殖檢測和死活細胞染色顯示人臍帶干細胞能很好的增殖生長，提示雙相材料無毒性，有良好的生物相容性，可以作為組織工程椎間盤的理想載體。簡而言之，熔融紡絲法和成膠法制備的雙相支架，為構建組織工程椎間盤提供新思路，但是干細胞向椎間盤組織分化及在體內(nèi)外的再生修復情況仍有待研究。

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