吳 娟 邱綺虹 楊驥鋒 梁 敏

慢性牙周炎是口腔科常見疾病之一，牙槽骨破壞是其重要病理特征，最終導致牙松動、脫落。局部菌斑微生物是牙周炎的始動因子，而全身性因素如糖尿病、代謝綜合征等系統疾病可促進牙周炎發展[1,2]。近年來研究表明，代謝綜合征可加重牙周炎癥狀，增加失牙風險[3-6]。代謝綜合征以腹型肥胖、高血壓及糖脂代謝紊亂為特征，糖脂代謝紊亂常誘發高血糖高血脂[7]。Gong等發現高糖高脂通過抑制成骨分化相關基因的表達，削弱成骨細胞分化能力[8,9]，并增強破骨細胞骨吸收水平[10]。健康牙周狀況下，成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收處于平衡狀態，維持牙槽骨的正常形態與功能。在實驗性牙周炎動物模型中，成骨細胞凋亡增多導致新骨形成減少，影響牙槽骨的修復重建，加重牙槽骨缺失及牙周炎病情[11]。高糖高脂條件下，胰島β細胞、心肌細胞及血管內皮細胞增殖活性下降，凋亡增加[12-15]，但鮮有文獻報道，高糖高脂是否影響成骨細胞增殖及凋亡。我們前期實驗發現，高糖高脂引起成骨細胞正常形態的改變，在此基礎上進一步研究高糖高脂對成骨細胞增殖及凋亡的影響，為探討代謝綜合征促進牙周炎癥加重的可能原因提供新思路。

1.材料與方法

1.1 實驗材料 棕櫚酸(PA)粉末(MPBiomedicals，美國)，D-葡萄糖(Sigma,美國)，小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14(MC3T3-E1 Subclone 14，中國科學院細胞庫提供)，胎牛血清(Gibco，美國)，青霉素鏈霉素雙抗(Gibco，美國)，α-MEM培養基(含D-glucose5.6mM，Gibco，美國)，CCK-8(Dojindo，日本)，Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒(Biosciences，美國)，RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、小鼠β-actin一抗及氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG二抗(上海碧云天)，小鼠cleaved caspase-3、caspase-3一抗(Cell Signaling Technology，美國)。

1.2 高糖高脂溶液的配置 根據文獻報道，研究者通常采用11mM-30mM糖濃度及或0.4mM棕櫚酸處理肝細胞、巨噬細胞、肝癌細胞等，構建代謝綜合征高糖高脂細胞模型[16-19]。稱量棕櫚酸(PA)粉末及NaOH共同溶于雙蒸水，使NaOH終濃度為0.01M，棕櫚酸終濃度為20.0mM，混勻后于70℃水浴30min得到PA/NaOH溶液。配置30%BSA溶液(w/v，溶于PBS)，按照BSA溶液和PA/NaOH溶液的體積比為33∶40混合得到PA/BSA的穩定儲備液，存放于-20℃[20]。使用時，每2ml完全培養基加入5.2mg的D-glucose及73uL的PA/BSA儲存液，0.22μm濾器除菌，最終得到D-glucose 20.0mM，PA 0.4mM，BSA 0.5%的高糖高脂溶液。

1.3 細胞培養 成骨細胞MC3T3-E1在含有10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素雙抗的α-MEM培養基中于5%CO2、37℃條件下培養，待細胞生長至80%-90%融合后傳代進行實驗。細胞培養分為兩組：實驗組使用含D-glucose 20.0mM，PA 0.4mM，BSA 0.5%的高糖高脂溶液，對照組使用含0.5%BSA的完全培養基(含D-glucose5.6mM)。

1.4 細胞形態觀察 實驗組(D-glucose 20.0mM，PA 0.4mM，BSA 0.5%)及對照組(D-glucose 5.6mM，BSA 0.5%)細胞培養24h、36h、48h后，分別在倒置相差顯微鏡(Axiovert 40,美國)下觀察細胞形態學變化。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖 成骨細胞以1500個/孔接種至96孔板，培養24h后加入完全培養基或高糖高脂溶液處理0、12、24、36、48h，每組設5個復孔，每孔100ul培養基。將培養基和CCK-8按照體積比9∶1混合，去除處理液后每孔加入CCK-8混合液100uL，37℃避光孵育2h，450nm波長下檢測吸光度值。實驗獨立重復3次。

1.6 Annexin V/PI雙染流式檢測細胞凋亡 成骨細胞以2×105個/瓶接種于25cm2培養瓶，每瓶3ml培養基，培養36h后高糖高脂(D-glucose 20.0mM，PA 0.4mM，BSA 0.5%)處理細胞 0、24、30、36h，依據Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒說明書，收集細胞，用1×Binding Buffer重懸調整細胞濃度至1×109/L，加入Annexin V和PI染液室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測，凋亡率=C4早期凋亡細胞率+C2晚期凋亡細胞率。實驗獨立重復3次。

1.7 Western blotting檢測cleaved caspase3和caspase-3的表達 成骨細胞以2×105個/瓶接種于25cm2培養瓶，每瓶3ml培養基，培養36h后高糖高脂(D-glucose 20mM,PA 0.4mM，BSA 0.5%)處理細胞 0、6、12、24、36h，RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測樣本蛋白濃度，按照每泳道35ug總蛋白，10%SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白，轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，4℃孵育小鼠 cleaved caspase-3、caspase-3(1∶1000)及小鼠β-actin一抗(1∶1000)16至18h，常溫孵育氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG二抗(1∶1000)1h，Image Auant Las4000mini超靈敏化學發光成像儀(GE Healthcare，瑞典)檢測，Image J軟件(美國國立衛生研究院)進行條帶灰度值檢測與分析。目的蛋白相對表達量=目的條帶灰度值/內參條帶灰度值，其中β-actin為內參。實驗獨立重復3次。

1.8 統計學分析 采用統計學軟件SPSS19.0進行數據分析，統計數據采用均數±標準差(x±s)表示。組間比較采用單因素方差分析(one w ay ANOVA)，LSD法進行兩兩比較，以雙側p＜0.05為具有統計學意義。

2.結果

2.1 高糖高脂引起成骨細胞形態改變 倒置相差顯微鏡下觀察，對照組成骨細胞輪廓清晰，呈梭形或多角形，細胞間呈鋪路石樣緊密連接(圖1A-圖1C)。高糖高脂培養24h時觀察到細胞變得稀疏，形態皺縮，胞間間隙增寬，且隨培養時間延長，該現象更加明顯(圖1D-圖1F)，提示高糖高脂可改變成骨細胞正常形態。

2.2 高糖高脂抑制成骨細胞增殖 圖2所示，培養成骨細胞0、12、24、36、48h，CCK-8檢測發現對照組細胞呈指數式增殖，高糖高脂組24h時吸光度值(0.065±0.013)較同時刻對照組(0.237±0.048)降低，差異有統計學意義(F24h=24.489，P=0.001)，36、48h分別降低至0.032±0.022和0.027±0.022，與同時刻對照組相比差異更顯著(F36h=124.319，p＜0.001；F48h=272.440，p＜0.001)，提示高糖高脂呈時間依賴性抑制細胞增殖。

圖1 高糖高脂處理24、36、48h后成骨細胞的形態變化

圖2 高糖高脂處理成骨細胞0-48h后的增殖活性

2.3 高糖高脂促進成骨細胞凋亡 高糖高脂處理成骨細胞0、24、30、36h后，Annexin V/PI雙染流式檢測細胞凋亡，凋亡率=C4早期凋亡細胞率+C2晚期凋亡細胞率(圖3A)。圖3B所示，高糖高脂組24h時凋亡率(9.68%±3.33%)與對照組(1.96%±1.32%)相比差異有統計學意義(F=6.274，P=0.022)，36h時凋亡率(12.89%±3.40%)上升至對照組6.6倍(P=0.004)，提示高糖高脂呈時間依賴性促進成骨細胞凋亡。

圖3 高糖高脂培養0-36h后成骨細胞凋亡情況

2.4 高糖高脂上調cleaved caspase-3蛋白水平 Western blotting結果顯示，健康成骨細胞表達caspase-3，在相對分子量為35k Da處可見清晰條帶，但極少表達活化的cleaved caspase-3；高糖高脂時間依賴性上調cleaved caspase-3蛋白水平，在17k Da處可見逐漸增強的條帶，caspase-3蛋白水平不變(圖4A)。圖4B所示，高糖高脂處理成骨細胞24h后，cleaved caspase-3相對表達量(0.349±0.068)較對照組(0.146±0.033)升高約2.4倍(F=9.603，P=0.016)，36h時蛋白水平(0.468±0.136)約為對照組的3.2倍，差異更顯著(F=9.603，P=0.001)，提示高糖高脂呈時間依賴性上調cleaved caspase-3表達,與細胞凋亡相呼應。

圖4 高糖高脂處理成骨細胞0-36h后caspase-3、cleaved caspase-3蛋白水平

3.討論

大量研究表明，代謝綜合征與牙周炎相互影響。Iwasaki等發現，代謝綜合征可增加牙周炎的發病風險[5]。高密度脂蛋白膽固醇降低、空腹血糖升高及腹部肥胖這三項危險因素與牙周疾病密切相關，牙周炎患者合并有代謝綜合征時，牙周袋加深，附著喪失加重[3]。同時，牙周健康狀況與代謝綜合征的發生相關。縱向觀察顯示，深牙周袋患者有更高幾率出現代謝綜合征臨床癥狀[21]。維持良好的口腔衛生有助于降低罹患代謝綜合征的風險[22]。因此，探討代謝綜合征與牙周疾病關系的機制具有臨床價值。

糖脂代謝紊亂是代謝綜合征的重要臨床特征，表現為高糖高脂血癥[7]。高血脂最常見類型是總甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇水平升高，伴高密度脂蛋白膽固醇水平下降[23]，其中引起細胞毒性的脂質有甘油三酯、游離膽固醇、游離脂肪酸等。代謝綜合征患者靜脈血游離脂肪酸濃度為(0.40±0.10)mM[24]，棕櫚酸屬于游離飽和脂肪酸，體外實驗常用0.4mM棕櫚酸作為高脂培養條件[15,16,25]。Ying等發現0.4mM棕櫚酸作用心肌細胞24h后細胞增殖活性受抑制，凋亡率上升[25]。臨床上暫無文獻報道齦溝液中游離脂肪酸的濃度，但有學者發現齦溝液中可檢測到載脂蛋白B，其濃度約為靜脈血的25倍[26]，載脂蛋白B是低密度脂蛋白膽固醇的主要結構蛋白，它的測定可直接反應低密度脂蛋白膽固醇的水平。研究表明，齦溝探診出血及指尖采血的血糖濃度在個體內均有高度相關性，提示口腔微環境與全血血糖濃度相近[27]。體外實驗構建高糖細胞模型時常采用11mM-30mM糖濃度，研究高糖環境對血管內皮細胞、胰島β細胞、成骨細胞等的作用[12,17,18,28,29]。Sidarala等發現20.0mM葡萄糖可激活胰島β細胞線粒體凋亡通路[28]。

我們發現20.0mM葡萄糖及0.4mM棕櫚酸培養成骨細胞24h時，細胞開始出現皺縮、脫落，胞間間隙增寬，此時細胞增殖活性較同時刻對照組降低(F24h=24.489，P=0.001)，凋亡率上升至對照組的5倍(F=6.274，P=0.022)，且高糖高脂對成骨細胞增殖的抑制及凋亡的促進呈時間依賴性。高糖高脂可影響細胞多種生物學特性，如增殖、凋亡、細胞形態等。胰島β細胞在高糖高脂作用下，細胞周期抑制劑p16、p18表達增加，阻礙D-cyclins調控作用，細胞增殖能力下降[15]；且高糖高脂可促進胰島β細胞釋放ATP，ATP在胞外降解為ADP并與嘌呤能受體P2Y13結合，活化caspase-3，誘導細胞凋亡[30]。Caspase-3是凋亡通路中關鍵蛋白，經上游蛋白酶剪切為cleaved caspase-3活化，可降解細胞骨架蛋白、核蛋白等，引起細胞形態學變化，還可降解MEK激酶、PKA2促進凋亡[31]。我們實驗結果顯示，高糖高脂處理成骨細胞24h后，cleaved caspase-3蛋白水平顯著增高，且相對表達量呈時間依賴性上調，與凋亡吻合。Pacios等在大鼠實驗性牙周炎模型中發現，成骨細胞凋亡增加導致新骨形成減少，使用半胱天冬酶-3(caspase-3)抑制劑可減少成骨細胞凋亡、促進新骨形成，說明cleaved caspase-3參與成骨細胞的凋亡過程[11]。

綜合我們實驗結果及前人研究，顯示高糖高脂從多個方面影響骨組織的改建，表現為：①高糖高脂呈時間依賴性抑制成骨細胞增殖，促進凋亡，引起細胞數量減少；②成骨細胞在高糖高脂環境中堿性磷酸酶活性下降，Runx2、COL1α的mRNA及蛋白水平下調，礦化結節數量減少，成骨能力減弱[8,9]；③高糖或高脂可增強破骨細胞骨吸收水平[10]。綜上，高糖高脂通過減少成骨細胞數量、削弱成骨分化能力、提高破骨吸收水平，打破骨形成與吸收的平衡狀態，影響牙槽骨的修復重建，可能是代謝綜合征加重牙周炎癥的原因之一。探討高糖高脂環境下保護成骨細胞的有效方法，并促進成骨分化及抑制破骨細胞骨吸收，對臨床治療牙周炎有重要意義。

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