RNA干擾FAK表達抑制宮頸癌細胞侵襲、遷移能力的研究

封菊，苑中甫，邱海峰

焦作煤業(yè)（集團）有限責任公司中央醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 焦作 454000

宮頸癌是婦科常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴重威脅女性的健康，近年來的發(fā)病率呈現(xiàn)年輕化趨勢，且發(fā)病率在全球范圍內居女性惡性腫瘤的第2位、常見惡性腫瘤的第4位[1]。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與癌基因的抑制和抑癌基因的激活等因素有關[2]。目前，對于宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展機制還處于研究階段，隨著分子生物科技的發(fā)展，宮頸癌診斷和治療的研究重點逐漸轉移到分子水平上[3]。黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是一種存在于細胞質的非受體酪氨酸激酶，在多種組織中高表達且具有較高的蛋白同源性，是細胞內多條信號傳導通路的關鍵因子，在腫瘤的進展、增殖、凋亡等過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用[4]。據(jù)研究，F(xiàn)AK在大腸癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、肝癌、胃癌中異常表達，與細胞的侵襲、遷移和惡性增殖有關[5-6]。但FAK在宮頸癌中的報道較少，所以本研究通過RNA干擾FAK的表達，研究其對宮頸癌細胞侵襲、遷移能力的影響以及作用機制，以期為宮頸癌的診斷、治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌HeLa細胞株購自中國科學院上海細胞庫；FAK-pGenesil-siRNA真核表達載體由鄭州大學實驗室保存；Transwell小室購自美國Corning公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；蛋白提取試劑盒購自上海碧云天公司；FAK抗體、基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）抗體、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）抗體、上皮細胞鈣黏蛋白（epithelial-cadherin，E-cadherin）抗體、β-actin抗體、鼠抗兔二抗均購自美國abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

將凍存的細胞置于37℃水浴鍋中至完全溶解，加入新鮮的含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，每1～2 d更換新鮮培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，0.25%胰酶消化收集細胞進行傳代，取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 細胞轉染

細胞轉染前1 h將細胞培養(yǎng)基更換為無抗生素的培養(yǎng)基，胰酶消化成單細胞懸液，計數(shù)，以每孔1×106接種于6孔板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞融合度達80%左右時按轉染試劑說明書進行轉染。實驗分3組，空白對照組：Lipofectamine 2000；陰性對照組：Lipofectamine 2000，F(xiàn)AK-pGenesil-Ctrl；干擾組 ：Lipofectamine 2000，F(xiàn)AK-pGenesil-siRNA。置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后更換含10%胎牛血清和雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，Western blot法檢測轉染效果。

1.4 Transwell法檢測細胞的遷移、侵襲能力

實驗前將提前配置好的Matrigel膠包被在Transwell小室基底膜的上室，37℃，30 min，紫外線照射過夜。取轉染培養(yǎng)48 h的細胞胰酶消化，用無血清培養(yǎng)基重懸成單細胞懸液，調整細胞密度至1×106；取200 μl細胞懸液加入已包被基底膜的小室上室中，下室中加入600 μl 10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，置于24孔板中，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用棉簽輕輕拭去Matrigel膠和上室中未穿出的細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，95%乙醇固定15 min，瑞士染色20 min，在倒置顯微鏡下取5個視野（上、下、左、右、中）計數(shù)，取平均數(shù)，表示細胞侵襲、遷移能力，每組3個復孔。遷移實驗中小室上室不包被Matrigel膠，其余與侵襲實驗相同。

1.5 Western blot法檢測轉染細胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin的蛋白表達量

取各組轉染48 h的宮頸癌細胞，加入1 ml細胞裂解液和10 μl苯甲基磺酰氟（phenylemthanesulfonyl flyoride，PMSF），冰上放置30 min，在4 ℃離心機中12 000 rpm離心20 min，將上清移至干凈的Eppendorf管中，-20℃保存，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度。采用12%的分離膠和5%的濃縮膠覆蓋在電泳槽中，加入變性蛋白樣品和1×上樣緩沖液，接入電壓電泳，待溴酚藍到達膠的底部，終止電泳，去除濃縮膠，保留分離膠。將凝膠轉入聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過夜，Tris-HCl緩沖鹽溶液+Tween（TBST）清洗3次，每次10 min，加入二抗，室溫搖床上孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min。顯色液進行顯色，反應15 min，晾干。用凝膠成像系統(tǒng)進行分析，以目的條帶灰度值與內參β-actin灰度值的比值為各目的蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RNA干擾宮頸癌細胞對FAK蛋白表達的影響

Western blot法檢測FAK蛋白表達情況，空白對照組、陰性對照組、干擾組中宮頸癌細胞FAK蛋白的表達量分別為（0.735±0.082）、（0.715±0.091）、（0.362±0.049）。陰性對照組細胞中FAK蛋白表達量與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）；干擾組細胞中FAK蛋白表達水平低于空白對照組及陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。（圖1、表1）

圖1 RNA干擾宮頸癌細胞對FAK蛋白表達的影響

表1 RNA干擾宮頸癌細胞對FAK蛋白表達的影響（±s）

注：a與空白對照組比較，P<0.05；b與陰性對照組比較，P<0.05

組別FAK蛋白表達量

2.2 RNA干擾宮頸癌細胞對其遷移能力的影響

Transwell法檢測宮頸癌細胞株HeLa轉染48 h后遷移能力的變化。空白對照組、陰性對照組、干擾組細胞的遷移數(shù)分別為（142.620±15.142）、（138.643±10.275）、（45.733±3.565）。陰性對照組與空白對照組遷移細胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）；干擾組的遷移細胞數(shù)少于陰性對照組與空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。（表2）

表2 RNA干擾宮頸癌細胞對其遷移能力的影響（±s）

表2 RNA干擾宮頸癌細胞對其遷移能力的影響（±s）

注：a與空白對照組比較，P<0.05；b與陰性對照組比較，P<0.05

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2.3 RNA干擾宮頸癌細胞對其侵襲能力的影響

Transwell法檢測宮頸癌細胞株HeLa轉染48 h后侵襲能力的變化。空白對照組、陰性對照組、干擾組細胞的侵襲數(shù)分別為（113.550±9.432）、（109.837±9.109）、（30.254±2.141）。陰性對照組與空白對照組侵襲細胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）；干擾組的侵襲細胞數(shù)少于陰性對照組與空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。（表3）

表3 RNA干擾宮頸癌細胞對其侵襲能力的影響（±s）

表3 RNA干擾宮頸癌細胞對其侵襲能力的影響（±s）

注：a與空白對照組比較，P<0.05；b與陰性對照組比較，P<0.05

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2.4 RNA干擾對宮頸癌細胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白表達的影響

Western blot法檢測轉染后細胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白表達量的變化。陰性對照組細胞中MMP-2、MMP-9和E-cadherin的蛋白表達量與空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）；干擾組細胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表達量低于空白對照組和陰性對照組，E-cadherin的蛋白表達量高于空白對照組和陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。（圖2、表4）

圖2 RNA干擾對宮頸癌細胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白表達的影響

表4 RNA干擾對宮頸癌細胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白表達量的影響（±s）

表4 RNA干擾對宮頸癌細胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白表達量的影響（±s）

注：a與空白對照組比較，P<0.05；b與陰性對照組比較，P<0.05

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3 討論

宮頸癌的治療一般采取手術與放化療等方式，但仍然有部分患者死于復發(fā)和遠處轉移，因此需要尋找更加明確的反映宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的分子標志物，為宮頸癌的治療方案提供合理的理論依據(jù)[7]。FAK首次發(fā)現(xiàn)于轉染的V-Src雞胚成纖維細胞中，位于人染色體8q24，相對分子質量為125 kD，共翻譯1052個氨基酸[8]。研究報道證實，F(xiàn)AK在多種實體和非實體腫瘤中高表達，參與細胞的黏附、增殖、運動、轉移等生命過程[9]。當細胞外基質與整合素受體群和細胞發(fā)生反應時，活化FAK，對細胞黏附、運動、遷移具有重要意義[10]。FAK可以與Src激酶形成復合物，活化促分裂素原活化蛋白激酶等下游蛋白，從而調節(jié)腫瘤細胞的侵襲、遷移、生長等過程[12-13]。研究報道表明，PF-00562271、VS-4718、VS-6063等FAK抑制劑可抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移，因此可將FAK作為腫瘤疾病治療的分子靶點[14]。在宮頸癌中，F(xiàn)AK的表達量隨著宮頸癌病變臨床分期、淋巴結轉移等的發(fā)展逐漸增高[15]。但關于FAK對宮頸癌細胞侵襲、遷移及其作用機制的研究較少。本研究通過靶向FAK的siRNA質粒，轉染宮頸癌HeLa細胞株，發(fā)現(xiàn)FAK表達量下調可以抑制細胞的侵襲、遷移能力，所以推測FAK可能與侵襲、遷移相關蛋白作用，從而阻礙腫瘤細胞的運動。

惡性腫瘤的基本生物學特征為細胞的侵襲、遷移，其作用機制一直是研究的熱點問題。研究報道顯示，惡性腫瘤侵襲、遷移的重要機制之一是上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），其主要標志是E-cadherin等上皮標志物表達量降低[16-17]。EMT是指正常情況和病變情況下，極性上皮細胞失去極性，黏附力下降，從而極易脫離細胞群而發(fā)生侵襲、遷移[18]。在結腸癌中，F(xiàn)AK的表達量降低可使E-cadherin的表達上升并增加細胞的黏附性，抑制腫瘤細胞的擴散、轉移[19]。MMP是EMT的標志分子，能降解細胞外機制，破壞細胞基底膜的連續(xù)性和完整性，從而引起胰腺癌、肝癌、乳腺癌細胞的增殖和侵襲[20-21]。研究表明FAK信號通路可以促進MMP尤其是MMP-2、MMP-9的分泌，從而誘導血管生成、細胞浸潤[18]。所以為了探究FAK影響宮頸癌細胞侵襲、遷移的作用機制，本實驗檢測了各組細胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin的表達，結果發(fā)現(xiàn)轉染了siRNA重組質粒的細胞中MMP-2、MMP-9的表達量降低，E-cadherin的表達量升高，表明FAK通過調控MMP-2、MMP-9、E-cadherin等EMT標志物的表達量進而影響細胞的侵襲、遷移。

綜上所述，RNA干擾FAK的表達通過影響細胞EMT過程從而抑制宮頸癌HeLa細胞的侵襲、遷移能力，阻礙腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

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