原花青素對食管癌細胞增殖及糖酵解的影響及作用機制研究

王俊鋼，楊麗，田君娜，張潔

南陽市中心醫院胸外科，河南 南陽 473009

食管癌是一種常見的食管腫瘤，約占全部食管腫瘤的90%。食管癌嚴重威脅著人類的生命健康，據統計世界范圍內每年約有超過20萬人死于食管癌[1]。癌細胞的能量代謝方式與正常細胞不同，正常細胞在有氧條件下以有氧氧化為主，只有在供氧不足時才會啟動糖酵解途徑供能，而癌細胞無論是在有氧條件還是在缺氧條件下均優先以糖酵解途徑供能，癌細胞的這種能量代謝方式使其在缺氧條件下具有更強的耐受能力[2]。原花青素具有抗氧化、消除氧自由基、消炎、抗過敏、抗心律失常等作用，廣泛存在于植物木實部以及果實的皮中[3]。有研究表明，原花青素能夠抑制胃癌、胰腺癌、卵巢癌等多種癌細胞的增殖，抑制癌癥的發生和發展[4-5]。為了明確原花青素對食管癌細胞增殖和糖酵解的影響，本研究采用MTT、Western blot等多種實驗方法對原花青素的作用及機制進行探討，以期為原花青素治療食管癌提供理論依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞

食管癌細胞株OE33、CP-C、Eca109均購自中國科學院細胞庫。

1.2 主要試劑

RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜、胰蛋白酶均購自美國Sigma公司；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；乳酸含量檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）活性檢測試劑盒、己糖激酶（hexokinase，HK）活性檢測試劑盒均購自美國Cayman公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；Akt單克隆抗體、p-Akt單克隆抗體、信號轉導與轉錄因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）單克隆抗體、磷酸化的STAT3（p-STAT3）單克隆抗體均購自美國Santacruze公司；牛血清白蛋白購自上海博谷生物科技有限公司；原花青素（提取自葡萄籽中）購自西安天行健生物制品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 取出保存在液氮中的人食管癌細胞株OE33、CP-C、Eca109，置于37 ℃環境下，使細胞在1 min內融化，加入RPMI1640培養基混合后，1000 r/min離心10 min，棄上清，用含有10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養液重懸細胞，接種到細胞培養瓶中，在37℃，5%CO2培養箱中培養3 d。在顯微鏡下觀察細胞融合度達到80%后，吸除細胞培養液，加入磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌 2次，1000 r/min離心 10 min，棄上清液，加入0.25%的胰蛋白酶消化細胞，消化溫度為37℃，觀察細胞呈單個存在時，轉移至離心管中1000 r/min離心10 min，棄酶蛋白酶消化液，用新鮮的細胞培養液懸浮細胞，按照實驗要求按不同比例接種到細胞培養瓶中。

1.3.2 MTT法檢測細胞增殖情況 取培養至對數生長期的食管癌細胞株OE33、CP-C、Eca109，胰蛋白酶消化后，離心，用細胞培養液懸浮細胞，按照每孔加入3000個細胞接種到96孔細胞培養板中。觀察細胞完全貼壁后，將細胞培養液更換成含有0、60、120、180、240、300 μmol/L原花青素的細胞培養液，同時以不加入細胞的組為空白組，每個濃度梯度設置6個復孔。培養48 h后，在每孔中加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml），在37 ℃孵育反應4 h后，吸除上清液，每孔加入150 μl的二甲基亞砜溶液，在搖床室溫環境下緩慢振蕩8 min，觀察結晶物充分溶解后，酶標儀檢測各組的光密度值（optical density，OD），計算細胞存活率，以0 μmol/L原花青素作用組為對照。細胞存活率=[（原花青素作用組OD值-空白OD值）/（對照OD值-空白OD值）]×100%。

1.3.3 ATP含量檢測 用半數抑制濃度的原花青素作用于人食管癌細胞株Eca109 48 h后，棄上清液，加入胰蛋白酶消化細胞后，用生理鹽水反復洗滌細胞，加入超純水懸浮細胞，將細胞制成細胞懸浮液。用勻漿器勻漿后，轉移到EP管中，于100℃的水浴鍋中孵育10 min。按照ATP檢測試劑盒說明書檢測細胞中ATP的含量。

1.3.4 乳酸含量檢測 用半數抑制濃度的原花青素作用于人食管癌細胞株Eca109 48 h后，吸取細胞培養液上清，根據乳酸含量檢測試劑盒說明書檢測上清液中的乳酸含量。

1.3.5 丙酮酸激酶和己糖激酶活性檢測 用半數抑制濃度的原花青素作用于人食管癌細胞株Eca109 48 h后，用丙酮酸激酶活性檢測試劑盒和己糖激酶活性檢測試劑盒分別檢測并計算細胞中丙酮酸激酶和己糖激酶的活性。

1.3.6 Western blot法檢測 Akt、p-Akt、STAT3、p-STAT3水平 采用半數抑制濃度的原花青素作用于Eca109細胞株細胞48 h后，提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測提取的蛋白濃度。取出蛋白樣品與2×Loading buffer按照1∶1的比例混合均勻，于100℃煮沸5 min使蛋白變性。按照每孔加入40 μl變性蛋白樣品加入到聚丙烯酰氨凝膠（8%分離膠，5%濃縮膠）電泳上樣孔中。在45 mV恒流條件下電泳。取出蛋白凝膠，在4℃，25 mV恒流條件下轉膜90 min。用5%牛血清白蛋白在37℃封閉60 min。800倍稀釋一抗，4℃反應過夜；1000倍稀釋二抗，37℃反應90 min，滴加顯色液，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為 內參，分析目的蛋白表達水平，實驗重復3次，取均值。

1.4 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。計量資料采用均數±標準差（±s）進行描述，組間比較采用t檢驗。以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖檢測結果

60、120、180、240、300 μmol/L原花青素作用后，OE33、CP-C、Eca109細胞的細胞存活率均較0 μmol/L組下降，差異有統計學意義（P﹤0.05）。隨著原花青素作用濃度的升高，OE33、CP-C、Eca109細胞的細胞存活率均下降（P﹤0.05）。OE33、CP-C、Eca109細胞的原花青素半數抑制濃度分別為（285.48±3.58）μmol/L、（291.00±3.36）μmol/L、（237.95±4.91）μmol/L。原花青素對Eca109細胞的抑制作用最大，后續選用240 μmol/L原花青素作用于Eca109細胞繼續研究。（表1）

表1 不同濃度原花青素作用于人食管癌細胞株后的細胞存活率（%，±s）

表1 不同濃度原花青素作用于人食管癌細胞株后的細胞存活率（%，±s）

注：a與0 μmol/L組比較，P<0.05；b與60 μmol/L組比較，P<0.05；c與120 μmol/L組比較，P<0.05；d與180 μmol/L組比較，P<0.05；e與240 μmol/L組比較，P<0.05

原花青素濃度（μmol/L）0（n=3）60（n=3）120（n=3）180（n=3）240（n=3）300（n=3）人食管癌細胞OE33 100.05±3.23 92.84±5.93a 85.36±4.90ab 69.18±5.37abc 58.63±5.57abcd 44.85±5.81abcde CP-C 100.06±6.92 94.25±4.52a 86.15±6.31ab 72.31±3.54abc 63.17±2.87abcd 46.84±3.82abcde Eca109 100.00±3.65 92.31±6.52a 83.64±4.65ab 66.15±8.64abc 48.25±3.61abcd 40.85±4.69abcde

2.2 ATP及乳酸含量檢測結果

240 μmol/L原花青素作用后，Eca109細胞中的ATP及乳酸含量均較0 μmol/L組降低，差異有統計學意義（P﹤0.05）。（表2）

表2 不同濃度原花青素作用后Eca109細胞中ATP及乳酸含量的比較（mmol/L，±s）

表2 不同濃度原花青素作用后Eca109細胞中ATP及乳酸含量的比較（mmol/L，±s）

注：a與0 μmol/L組比較，P<0.05

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2.3 丙酮酸激酶及己糖激酶活性檢測結果

240 μmol/L原花青素作用后，Eca109細胞的丙酮酸激酶及己糖激酶活性均較與0 μmol/L組降低，差異有統計學意義（P﹤0.05）。（表3）

表3 不同濃度原花青素作用后Eca109細胞中丙酮酸激酶及己糖激酶活性的比較（U/mg，±s）

表3 不同濃度原花青素作用后Eca109細胞中丙酮酸激酶及己糖激酶活性的比較（U/mg，±s）

注：a與0 μmol/L組比較，P<0.05

原花青素濃度（μmol/L）0（n=3）240（n=3）t值P值丙酮酸激酶0.86±0.06 0.41±0.03a 11.619 0.000己糖激酶5.36±0.06 3.21±0.02a 58.880 0.000

2.4 Akt、p-Akt、STAT3、p-STAT3表達水平檢測結果

240 μmol/L原花青素作用后，Eca109細胞中的 Akt、STAT3水平與 0 μmol/L 組比較，差異無統計學意義（P﹥0.05）。240 μmol/L原花青素作用后，Eca109細胞中的p-Akt、p-STAT3水平均較0 μmol/L組降低，差異有統計學意義（P﹤0.05）。（圖1）

圖1 不同濃度原花青素作用后Eca109細胞中Akt、p-Akt、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平

3 討論

原花青素是一類多酚化合物的總稱，有二聚體、三聚體等多種形式。最初的研究表明，原花青素可以與多種蛋白質或消化酶結合形成化合物調控食物的吸收過程，隨著研究的不斷深入發現原花青素還具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗炎等多種藥理學作用[6-7]。Ma等[8]研究表明，原花青素可以抑制胰腺癌細胞AsPC-1的增殖、遷移和侵襲過程。潘曉婧等[9]研究發現，原花青素可以增加宮頸癌細胞HeLa的重離子輻射敏感性。Kim等[10]研究發現，100～300 μg/ml的原花青素能夠呈濃度和時間依賴的抑制前列腺癌細胞PC-3的增殖。以上研究結果均表明，原花青素能夠抑制腫瘤細胞的增殖。本研究結果發現，不同濃度的原花青素對三株食管癌細胞均具有增殖抑制作用，并且增殖抑制作用隨著原花青素作用濃度的增加而增加，這與之前的研究報道一致，均說明原花青素具有抗腫瘤的作用。

腫瘤細胞的能量代謝途徑與正常細胞不同，無論是在缺氧還是氧氣充足的情況下均以糖酵解途徑供能[11]。在糖酵解過程中有多種限速酶，例如己糖激酶、乳酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、丙酮酸激酶等，這些酶的活性高低直接影響糖酵解途徑[12]。乳酸是糖酵解途徑的產物，糖酵解增加時，乳酸含量升高[13]。Zhao等[14]研究表明，miRNA-181b能夠促進結腸癌細胞糖酵解，而干擾miRNA-181b表達后結腸癌有氧糖酵解被抑制。王秀等[15]研究表明，通過干擾原癌基因垂體腫瘤轉化基因能夠降低卵巢癌細胞中的己糖激酶活性，抑制卵巢癌細胞增殖。Di等[16]研究表明，脯氨酸羥化酶 2（PHD2）下調后，結腸癌細胞LS174T乳酸分泌水平和ATP水平明顯升高。本研究結果表明，原花青素作用后食管癌細胞中己糖激酶、丙酮酸激酶活性降低，ATP含量降低，細胞分泌的乳酸減少，說明原花青素能夠抑制食管癌細胞的糖酵解途徑。

癌細胞的生長和能量代謝是一個極為復雜的過程，是細胞內信號轉導過程的最終結果。Akt信號通路和STAT3信號通路在腫瘤中異常激活，其磷酸化水平異常升高，參與調控腫瘤細胞的增殖和能量代謝過程[17]。Yu等[18]研究表明，抑制Akt信號通路能夠抑制缺氧環境和常氧環境下食管癌細胞中糖酵解酶的活性，降低培養液上清中乳酸含量，抑制食管癌細胞糖酵解途徑。潘曉林[19]的研究表明，miRNA-181b可以通過影響STAT3磷酸化水平干擾結腸癌細胞能量代謝。本研究結果顯示，原花青素能夠降低食管癌細胞中Akt磷酸化水平和STAT3磷酸化水平，提示原花青素可能通過作用于Akt信號通路和STAT3信號通路影響食管癌細胞的增殖和糖酵解。

綜上所述，原花青素可能通過抑制Akt信號通路和STAT3信號通路的激活抑制食管癌細胞增殖，干擾食管癌細胞糖酵解。本研究只在體外進行了細胞實驗，后續會在體內進一步研究其作用機制。本研究為進一步探討原花青素的抗腫瘤作用機制奠定了基礎，為原花青素治療腫瘤提供了理論基礎。

[1]Mariette C,Dahan L,Mornex F,et al.Surgery alone versus chemoradiotherapy followed by surgery for stage I and II esophageal cancer:final analysis of randomized controlled phase III trial FFCD 9901[J].J Clin Oncol,2014,32(23):2416-2422.

[2]Lee ZW,Teo XY,Tay EY,et al.Utilizing hydrogen sulfide as a novel antiⅢcancer agent by targeting cancer glycolysis and pH imbalance[J].Br J Pharmacol,2014,171(18):4322-4336.

[3]Wu YY,Cao TT,Liu CL.Combined effect of vorinostat and grape seed proanthocyanidins on modulation of thymidine phosphorylase in non-small cell lung cancer[J].Trop J Pharm Res,2015,14(6):953-959.

[4]Vaid M,Singh T,Prasad R,et al.Bioactive proanthocyanidins inhibit growth and induce apoptosis in human melanoma cells by decreasing the accumulation of β-catenin[J].Int J Oncol,2016,48(2):624-634.

[5]Prasad R,Katiyar SK.Grape seed proanthocyanidins inhibit migration potential of pancreatic cancer cells by promoting mesenchymal-to-epithelial transition and targeting NF-κB[J].Cancer Lett,2013,334(1):118-126.

[6]Weh KM,Aiyer HS,Howell AB,et al.Cranberry proanthocyanidins modulate reactive oxygen species in Barrett’s and esophageal adenocarcinoma cell lines[J].J Berry Res,2016,6(2):125-136.

[7]張妍,郭榮年,孫柳青,等.葡萄籽原花青素對腎血管性高血壓大鼠動態血壓,白細胞介素-18和白細胞介素-10水平的影響[J].中國老年學雜志,2015,35(24):7018-7020.

[8]Ma J,Fang B,Zeng F,et al.Grape seed proanthocyanidins extract inhibits pancreatic cancer cell growth through downregulation of miR-27a expression[J].Zhong Nan Da Xue Xue Bao,2015,40(1):46-52.

[9]潘曉婧,王敏,劉斌,等.葡萄籽原花青素對人宮頸癌細胞的輻射增敏作用[J].中藥藥理與臨床,2012,28(4):40-43.

[10]Kim J,McKeown B,Patel K,et al.Proanthocyanidins from the American cranberry(Vaccinium macrocarpon)induce cell cycle alterations in DU145 human prostate cancer cells in vitro by affecting the expression of cell cycleassociated proteins[J].Functional Foods in Health&Disease,2014,4(4):130-146.

[11]Wahlstr?m T,Henriksson MA.Impact of MYC in regulation of tumor cell metabolism[J].Biochim BiophysActa,2015,1849(5):563-569.

[12]Li XB,Gu JD,Zhou QH.Review of aerobic glycolysis and its key enzymes——new targets for lung cancer therapy[J].Thorac Cancer,2015,6(1):17-24.

[13]Mack N,Mazzio EA,Bauer D,et al.Stable shRNA silencing of lactate dehydrogenase A(LDHA)in human MDAMB-231 breast cancer cells fails to alter lactic acid production,glycolytic activity,ATP or survival[J].Anticancer Res,2017,37(3):1205-1212.

[14]Zhao LD,Zheng WW,Wang GX,et al.Epigenetic silencing of miR-181b contributes to tumorigenicity in colorectal cancer by targeting RASSF1A[J].Int J Oncol,2016,48(5):1977-1984.

[15]王秀,楊愛君,蔡鳳梅,等.PTTG沉默通過下調糖酵解相關酶抑制卵巢癌細胞增殖[J].中國婦幼健康研究,2016,27(11):1343-1347.

[16]Di Conza G,Trusso Cafarello S,Loroch S,et al.The mTOR and PP2A pathways regulate PHD2 phosphorylation to fine-tune HIF1α levels and colorectal cancer cell survival under hypoxia[J].Cell Rep,2017,18(7):1699-1712.

[17]Li Z,Li X,Wu S,et al.Long non-coding RNA UCA1 promotes glycolysis by upregulating hexokinase 2 through the mTOR-STAT3/microRNA143 pathway[J].Cancer Sci,2014,105(8):951-955.

[18]Yu VZ,Wong VC,Dai W,et al.Nuclear localization of DNAJB6 is associated with survival of patients with esophageal cancer and reduces AKT signaling and proliferation of cancer cells[J].Gastroenterology,2015,149(7):1825-1836.

[19]潘曉林.miR-181b通過激活STAT3調控結腸癌細胞有氧糖酵解的機制研究[D].南京:南京醫科大學,2013.