Numb蛋白及Numb/Notch信號通路對人胰腺癌細胞株放療敏感性的影響

盧曉玉

河南省腫瘤醫院病理科，鄭州 450000

胰腺癌是惡性程度最高的消化道腫瘤之一，居全球腫瘤死亡原因的第4位，在中國居第6位[1]。胰腺癌早期容易發生胰周侵襲和遠處轉移，導致其預后效果差，5年總體生存率低于5%[2]。因此，尋找與胰腺癌侵襲和轉移有關的分子標志物，對胰腺癌的早期診斷及判斷預后有至關重要的作用。Numb是在神經發育中被發現的第一個呈不對稱分布的蛋白，是細胞命運決定子，通過不對稱分裂對細胞分裂和分化的調控起重要作用[3]。近年來研究發現，Numb的突變或表達異常而導致細胞增殖與分化的不平衡與腫瘤的發生有著很大關系。Numb參與多種腫瘤信號通路的調控，與肝癌、乳腺癌、肺癌等均有關[4-7]。本研究主要探討Numb蛋白及其Numb/Notch信號通路對人胰腺癌細胞株放療敏感性的影響，旨在為胰腺癌的治療尋找新的靶標，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人胰腺癌MIA PaCa-2細胞株購自中國醫學科學院上海細胞庫。

1.2 儀器與試劑

10%胎牛血清購自美國Hyclone公司，DMEM培養基購自美國Gibco公司，0.25%胰酶購自美國Gibco公司，MTT溶液購自美國Sigma公司，DMSO購自美國Amresco公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，BCA蛋白購自美國Thermo公司，Numb、Notch1、Hes1和Hes5一抗購自美國CST公司，辣根過氧化物酶二抗購自英國Abcam公司；CO2培養箱購自美國Thermo公司，FACS Vantage流式細胞儀購自美國BD公司，ND-1000紫外/可見光分光光度計購自美國Nanodrop公司。

1.3 細胞培養

人胰腺癌MIA PaCa-2細胞株用含10%胎牛血清的DMEM培養基在5%CO2、37℃、濕度95%的CO2培養箱內培養。培養細胞呈單層生長，貼壁率應達90%。傳代時常規倒掉培養液，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗 2次，0.25%胰酶消化，見細胞間隙增大，傾去胰酶，DMEM培養基吹打使其成單細胞懸液，常規傳代。

1.4 電離輻射

取對數期生長的胰腺癌MIA PaCa-2細胞株，制備適宜細胞密度的懸液，接種細胞到合適的培養皿中，置于培養箱中培養12 h。釆用Varian 21 EX直線加速器，6 MV高能X線照射，劑量率3 Gy/min，分別以不同劑量（0、1、3、5 Gy）垂直輻射細胞，照射范圍10 cm×10 cm。將細胞放回培養箱，繼續培養48 h。

1.5 實驗方法

1.5.1 MTT比色法實驗 將MIA PaCa-2細胞接種到96培養孔板中，每孔接種3×105個細胞，每孔200 μl，培養12 h后進行X射線照射。繼續培養48 h后，每孔加20 μl 5 mg/ml MTT溶液顯色。4 h后棄液，每孔加入劑量為150 μl的DMSO，輕勻搖動10 min。酶聯免疫檢測儀上490 nm處測定各孔吸光度值。

1.5.2 細胞凋亡檢測 將MIA PaCa-2細胞接種到6孔板中，每孔接種3×103個細胞，培養12 h后進行X射線照射。繼續培養48 h后，離心收集各組細胞，PBS沖洗 2次，加入200 μl Binding Buffer振蕩混勻，加入2.5 μl Annexin V-FITC再次混勻，室溫避光反應10～15 min，上機前加5 μl PI，立即用流式細胞儀檢測。

1.5.3 劃痕實驗 用記號筆在6孔板背后每隔0.5～1 cm均勻劃一道橫線。將3×103個細胞種入劃好線的6孔板中，培養過夜。次日待細胞密度為80%～90%時，用槍頭垂直于背后的橫線劃痕。劃完后，進行X射線照射。繼續培養48 h后，每孔隨機選擇8個有劃痕穿過的視野，觀察劃痕處細胞運動情況，拍照取樣，計算相對劃痕寬度（相對于0 h劃痕寬度的百分率），反映細胞遷移能力。

1.5.4 Transwell實驗 將Matrigel基質膠4℃溶解過夜，用無血清DMEM培養基稀釋，加入每個Transwell小室的上室鋪膜，每次間隔10 min。接種細胞懸液于Transwell上室，每孔接種3×104個細胞，將0.5 ml含10%胎牛血清的DMEM培養基加入24孔板下室。采用結晶紫染色10 min。培養12 h后進行X射線照射。繼續培養48 h后，各組穿過Matrigel基質膠的細胞數量作為評價其侵襲能力的指標。

1.5.5 實時熒光定量RT-PCR檢測 按Trizol試劑說明書提取總RNA。溶解RNA后，使用ND-1000紫外/可見光分光光度計測量260 nm和280 nm下吸光度，調整RNA的濃度用于qRT-PCR。引物序列詳見表1。qRT-PCR反應體系按試劑盒說明書操作，反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性10 s；60℃退火20 s，70℃延伸10 s，共進行40個循環，以β-actin為內參，采用相對定量法計算，用2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達倍數。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5.6 Western blot檢測 Numb、Notch1、Hes1和Hes5蛋白表達 裂解細胞后，4℃條件下12 000 r/min離心10 min，吸取上清置于-20℃保存。BCA蛋白定量檢測后，將裂解好的蛋白樣品用雙蒸水稀釋；轉入96孔板中，每孔200 μl；37℃恒溫30 min，冷卻至室溫；酶標儀490 nm波長檢測樣品吸光度值，計算樣品蛋白濃度。電泳先用60 V，待進入分離膠后改用120 V。隨后，用濕轉電轉移法將蛋白質轉移到PVDF膜上，電轉移2 h，取下PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，室溫下孵育1～2 h。加入Numb、Notch1、Hes1和Hes5一抗，4 ℃過夜，TBST沖洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶二抗，室溫1 h，TBST洗3次，每次10 min。進行化學發光，X光片壓片、顯影、定影，數據分析。

1.6 統計學方法

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 6對數據進行統計分析。計量資料采用均數±標準差（±s）進行描述，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電離輻射對細胞增殖和凋亡的影響

MTT檢測輻射細胞活性結果顯示：MIA PaCa-2細胞在1、3、5 Gy的放射劑量下，細胞吸光度值均低于未受輻射細胞的吸光度值，差異有統計學意義（P﹤0.05），詳見圖1。細胞凋亡實驗結果顯示：MIA PaCa-2細胞在1、3、5 Gy的放射劑量下，細胞總凋亡率均高于未受輻射細胞的總凋亡率，差異有統計學意義（P﹤0.05），詳見圖2。

圖1 MTT法檢測不同劑量X射線作用后MIAPaCa-2胰腺癌細胞增殖情況

圖2 不同劑量X射線作用對MIAPaCa-2胰腺癌細胞凋亡的影響

2.2 電離輻射對細胞侵襲和遷移能力的影響

細胞劃痕實驗結果顯示：在0、1、3、5 Gy放射劑量作用48 h后，MIA PaCa-2細胞相對劃痕寬度分別為（16.54±1.38）%、（37.33±1.62）%、（47.25±1.62）%、（60.89±1.35）%，在1、3、5 Gy的放射劑量下受輻射的MIA PaCa-2細胞的遷移能力與未受輻射細胞比較，差異均有統計學意義（P﹤0.05），詳見圖3。Transwell侵襲實驗結果顯示：0～5 Gy放射劑量作用48 h后，受輻射的MIA PaCa-2細胞在1、3、5 Gy的放射劑量下，受輻射的細胞穿過小室底膜的數目均較未受輻射的細胞減少，差異有統計學意義（P﹤0.05），詳見圖4。

圖3 細胞劃痕實驗檢測不同劑量X射線作用對MIAPaCa-2胰腺癌細胞遷移的影響（×100）

圖4 Transwell實驗檢測不同劑量X射線作用對MIAPaCa-2胰腺癌細胞侵襲的影響（結晶紫染色，×200）

2.3 電離輻射對Numb/Notch信號通路及下游信號分子的影響

在不同劑量電離輻射的作用下，采用qRT-PCR和Western blot方法檢測Numb/Notch信號通路的經典下游分子 Numb、Notch1、Hes1和 Hes5的表達。與未受輻射的細胞相比，受輻射的細胞中Numb的mRNA和蛋白表達量增加，Notch1、Hes1和Hes5的mRNA和蛋白表達量降低，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。另外，隨著輻射劑量的增加，Notch1、Hes1和Hes5的表達量降低。（圖5）

圖5 不同劑量X射線作用對MIAPaCa-2胰腺癌細胞Numb/Notch信號通路相關蛋白表達水平的影響

3 討論

早前已有相關研究表明Numb與腫瘤有關，且在不同類型腫瘤組織中表達有所不同。例如在肝癌、肺癌及唾液腺癌中Numb表達下降，而在星形細胞瘤和宮頸鱗狀細胞癌中表達上調[8-9]。同時，Numb/Notch信號通路也在腫瘤發展進程及抗腫瘤治療過程中扮演重要角色[10-12]。本研究的主要創新之處在于首次報道了Numb/Notch信號通路對人胰腺癌細胞株放療敏感性的影響，具有新穎性。本研究通過培養人胰腺癌MIAPaCa-2細胞株，分別以0、1、3、5 Gy劑量輻射細胞，探討Numb/Notch信號通路對人胰腺癌細胞株放療敏感性的影響，為胰腺癌的治療尋找新的靶標。本研究主要提示Numb蛋白及Numb/Notch信號通路在胰腺癌細胞中均呈激活狀態，且Notch信號通路在胰腺癌細胞中激活的強弱與放射劑量的大小有關，本研究為深入了解胰腺癌發病的分子機制和尋找新的分子靶向治療靶點奠定理論基礎。

本實驗細胞分為4組，對照組不作任何處理，其余3組接受不同劑量的電離輻射。具體分析發現：MTT實驗和流式細胞術顯示，隨著輻射劑量的增加，人胰腺癌MIA PaCa-2細胞的增殖活力均有所下降，明顯低于未受輻射的細胞，提示人胰腺癌細胞株在電離輻射下增殖活力具有劑量依賴性。細胞劃痕實驗和Transwell實驗結果顯示，隨著輻射劑量的增加，MIA PaCa-2細胞的遷移和侵襲能力減弱，低于未受輻射的細胞，提示人胰腺癌細胞株MIA PaCa-2具有較高放療敏感性。qRT-PCR和Western blot方法檢測結果顯示，細胞隨著輻射劑量的增加，Numb表達量增加（P﹤0.05），Notch1、Hes1和Hes5的mRNA和蛋白表達量較未受輻射的細胞的表達量降低（P﹤0.05）。眾所周知，靶向治療時代的到來提示關注分子信號通路及其相關機制在腫瘤治療中的作用[13-15]。細胞克隆增殖具有無節制的特點，調控細胞增殖、遷移、侵襲能力可有效逆轉細胞生長周期，抑制腫瘤生長速度[16-17]。本研究發現，人胰腺癌細胞系在電離輻射下生長、遷移和侵襲能力具有劑量依賴性，且Numb/Notch信號通路在胰腺癌細胞中呈激活狀態。Numb/Notch信號通路作為一種經典的信號通路，具有高度保守性[18]。Numb/Notch信號通路的激活能夠上調下游Notch1表達，促進宮頸癌細胞的發展，而低表達的Notch1能夠促使細胞凋亡減少[19]；在非小細胞肺癌中，Notch2受體也呈現高表達[20]。在本研究中我們推測，電離輻射背景下，Numb/Notch信號通路通過上調Numb表達抑制Notch1、Hes1和Hes5表達，從而影響細胞生長、遷移和侵襲。

綜上所述，Numb/Notch信號通路在胰腺癌細胞中的強弱與X射線放射劑量的大小和胰腺癌細胞對放療的敏感程度有關。本研究意義在于證實Numb/Notch信號通路活性與胰腺癌放療敏感性的關聯，未來我們將設計相關阻斷藥阻斷胰腺癌細胞中Numb/Notch信號通路，探究阻斷Numb/Notch信號通路在提升放療敏感性中的可行性及臨床意義。

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