25%四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型血清AST、ALT水平變化*

杜 斌，蔡維維，陳俊良，侯 豹，邱麗穎△（1.江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫141；.江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院，江蘇無(wú)錫141）

采用四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)急性肝損傷模型，實(shí)驗(yàn)后檢測(cè)谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）中任意一項(xiàng)指標(biāo)和肝臟組織病理學(xué)診斷結(jié)果為陽(yáng)性，方可診斷為有效[1]。肝臟組織病理學(xué)診斷為有創(chuàng)損傷，因此具有一定的局限性。在臨床診斷中，以AST、ALT等肝功能指標(biāo)檢測(cè)和結(jié)合臨床癥狀為主。在研發(fā)和申報(bào)對(duì)化學(xué)性肝損傷具有保護(hù)作用的藥物及具有輔助性保護(hù)功能的保健食品時(shí)常采用實(shí)驗(yàn)大鼠或小鼠CCl4肝損傷模型作為檢驗(yàn)方法。CCl4是誘導(dǎo)急性肝損傷模型的經(jīng)典藥物，不同劑量CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷模型的病程和轉(zhuǎn)歸具有較大差異[2?6]。所以，本研究采用 25%CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型，觀察急性肝損傷小鼠血清AST、ALT水平變化，旨在為急性肝損傷模型的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及試劑 CCl4、橄欖油、戊巴比妥鈉均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AST、ALT檢測(cè)試劑均購(gòu)自桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司。

圖1 各組小鼠肝臟形態(tài)肉眼觀察

1.1.2 動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)儀器 56只癌癥研究所的小鼠（雄性）由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重（20.0±2.0）g；全自動(dòng)生化分析儀（URIT?8260）購(gòu)自桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（5427R）購(gòu)自德國(guó)艾本德公司；單道移液器購(gòu)自德國(guó)艾本德公司；電子天平（XPE105）購(gòu)自梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 急性肝損傷模型建立及分組 將56只雄性小鼠隨機(jī)（根據(jù)小鼠體重由低至高排序，確保每組小鼠體重相對(duì)均一）分為正常組和給藥 3、6、12、24、48、72 h組，每組8只。CCl4和橄欖油根據(jù)體積比混合，配置成25%CCl4溶液，腹腔注射給藥0.05 mL/10 g。正常組給予同體積橄欖油。

1.2.2 觀察指標(biāo)

1.2.2.1 肉眼觀察 正常組和給藥3、6、12、24、48、72 h組小鼠眼球內(nèi)眥靜脈叢取血，放血處死。打開(kāi)腹腔，迅速取出肝臟。肉眼觀察肝臟形態(tài)變化。

1.2.2.2 生化指標(biāo)測(cè)定 對(duì)各組小鼠眼球內(nèi)眥靜脈叢取血、分離血清。根據(jù)試劑盒及全自動(dòng)生化分析儀使用要求檢測(cè)血清ALT、AST水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠肝臟形態(tài)肉眼觀察 正常組小鼠肝臟薄膜光滑，顏色呈褐紅色；給藥組小鼠肝臟薄膜無(wú)光澤，顏色呈褐黃色，肝臟表面有顆粒狀樣變。給藥組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)肝臟肉眼觀察無(wú)明顯改變，見(jiàn)圖1。

2.2 各組小鼠血清ALT、AST水平比較 給藥組小鼠血清ALT、AST水平與正常組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；給藥 48 h組小鼠血清 ALT、AST 水平與給藥72 h組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給藥6 h組小鼠血清AST水平明顯升高，12 h達(dá)到峰值，且24、48、72 h維持較高水平；給藥3 h組小鼠血清ALT水平明顯升高，24 h達(dá)到峰值，48、72 h維持較高水平，見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清ALT、AST水平比較（±s，U/L）

表1 各組小鼠血清ALT、AST水平比較（±s，U/L）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與給藥 48、72 h 組比較，bP＜0.05

組別 n正常組 8給藥3 h組 8給藥6 h組 8給藥12 h組 8給藥24 h組 8給藥48 h組 8給藥72 h組 8 AST 48.0±12.6 174.7±21.8a 542.0±59.1ab 573.0±45.6ab 495.7±8.7a 477.8±44.8a 445.3±75.8a ALT 130.4±24.8 407.7±65.4ab 415.9±63.3ab 445.3±51.1ab 1 150.8±106.7ab 967.5±124.9a 825.2±92.2a

3 討 論

肝臟是人體最大的消化腺體，也是人體主要的代謝和防御器官。肝臟疾病是影響人類健康的最為常見(jiàn)疾病之一，對(duì)肝臟疾病的防治已為全世界所關(guān)注的問(wèn)題。

CCl4通過(guò)細(xì)胞色素P450系統(tǒng)的生物轉(zhuǎn)化，CCl4能產(chǎn)生高反應(yīng)性三氯甲基自由基和三氯甲基過(guò)氧自由基，從而誘發(fā)肝損傷[7]。CCl4誘導(dǎo)肝損傷動(dòng)物模型的肝細(xì)胞病理學(xué)特征與人類病毒性肝炎極為相似[8]。CCl4誘導(dǎo)肝損傷模型一直是篩選具有保肝降酶作用藥物的常用模型之一[9]。

AST主要分布于肝細(xì)胞的線粒體和細(xì)胞質(zhì)中，ALT主要分布于肝細(xì)胞質(zhì)中。正常情況下二者只有極少量釋放入血液，當(dāng)肝組織受到急性損傷或細(xì)胞膜通透性增加時(shí)這2種酶大量釋放到血液中，使血清中酶的水平顯著升高，1%肝細(xì)胞損傷時(shí)ALT水平即升高1倍[10]。ALT、AST升高被認(rèn)為是判斷急性肝損傷嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[11?13]。按肝損傷程度可分為可逆性肝損傷和非可逆性肝損傷。

CCl4的染毒劑量和持續(xù)接觸時(shí)間是影響其肝毒性的重要因素[5，14]。CCl4染毒小鼠肝損傷過(guò)重，肝細(xì)胞變性、壞死，自身修復(fù)能力受到嚴(yán)重影響[15]。

本研究旨在為CCl4選擇一種短時(shí)、高效的劑量，同時(shí)能反映肝臟的自我修復(fù)和損傷的病理生理過(guò)程。采用單次腹腔注射25%CCl4橄欖油溶液，誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)急性肝損傷模型。結(jié)果顯示，給藥后72 h組小鼠死亡率為0。肉眼觀察CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷的肝臟表面呈顆粒狀樣變。25%CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷模型血清AST水平6 h顯著升高，12 h達(dá)到峰值，24、48、72 h維持較高水平；血清ALT水平較3 h顯著升高，24 h達(dá)到峰值，48、72 h維持較高水平。因此，24 h前肝損傷處于進(jìn)展期，24 h后血清AST、ALT水平均較為平穩(wěn)。因此，選擇48 h或72 h為肝臟取材時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行血清AST、ALT水平檢測(cè)，更有利于篩選具有保肝降酶作用的藥物。

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