香煙煙霧提取物對小鼠C2C12細胞myostatin及炎癥介質的影響

李玉姬 周煦 裴興華 黃鸝 雷衍軍 張璐璐

[摘要]目的 探討香煙煙霧提取物（CSE）對小鼠C2C12細胞肌肉生長抑制素（myostatin）及炎癥介質的影響。方法 不同濃度CSE和（或）myostatin-siRNA刺激和（或）干擾小鼠C2C12細胞后利用MTT檢測CSE對細胞生長的影響，根據處理方式不同，實驗分為4個組，分別為對照組、5% CSE組、myostatin-siRNA組、5% CSE+myostatin-siRNA組，采用Real-time PCR檢測myostatin mRNA表達情況，采用Western blot檢測myostatin蛋白表達情況，采用ELISA檢測細胞培養液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素8（IL-8）含量。結果 5%以上的CSE處理能顯著抑制小鼠C2C12細胞增殖（P<0.05）；5%的CSE處理小鼠C2C12細胞48 h后，myostatin mRNA和蛋白表達明顯高于對照組（P<0.05），細胞培養液中IL-8和TNF-α含量明顯高于對照組（P<0.05）；siRNA干擾myostatin后再采用CSE處理小鼠C2C12細胞，細胞培養液中IL-8和TNF-α含量明顯低于CSE處理組（P<0.05）。結論 CSE上調小鼠C2C12細胞myostatin表達，增加炎癥介質釋放。

[關鍵詞]慢性阻塞性肺疾??；香煙煙霧提取物；肌肉生長抑制素；炎癥介質

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）2（b）-0004-04

Influence of cigarette smoke extract on myostatin and inflammatory mediators in mouse C2C12 cells

LI Yu-ji ZHOU Xu PEI Xing-hua HUANG Li LEI Yan-jun ZHANG Lu-lu

The First Department of Critical Care Medicine，Peopel′s Hospital of Hu′nan Province，Changsha 410005，China

[Abstract]Objective To investigate the effect of cigarette smoke extract on myostatin and inflammatory mediators in mouse C2C12 cells.Methods Different concentrations of CSE and/or myostatin-siRNA stimulated or interference mouse C2C12 cells，and then detected influence of CSE on cell growth by MTT，according to the different treatment methods，the experimental research objects were divided into the control group，5% CSE group，the myostatin-siRNA group，5% CSE+myostatin-siRNA group.Real-time PCR was used to detect the expression of myostatin mRNA，Western blot was used to detect expression of myostatin protein，ELISA was used to detected tumor necrosis factor alpha （TNF-alpha） and interleukin 8 （IL-8） level in cell culture medium.Results The CSE at the concentration above 5% could significantly inhibit the proliferation of C2C12 cells in mice （P<0.05）.The expression of myostatin mRNA and protein in C2C12 cells treated with 5% CSE was significantly higher than that of the control group after 48 h （P<0.05）.The content of IL-8 and TNF-alpha in the cell culture fluid was significantly higher than that in the control group （P<0.05）.After siRNA interfered with myostatin，the mouse C2C12 cells were treated with CSE，the content of IL-8 and TNF-alpha in cell culture solution was significantly lower than that in CSE treatment group （P<0.05）.Conclusion CSE can up-regulate the expression of myostatin and increase inflammatory mediators releasing from C2C12 cells.

[Key words]Chronic obstructive pulmonary disease；Cigarette smoke extract；Myostatin；Inflammatory mediator

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以進行性氣流受限為特點的炎癥反應性疾病[1]。吸煙是導致COPD發生的重要因素，香煙煙霧成分能刺激活性氧顯著增加并誘導炎癥反應[2]。除了肺部異常外，骨骼肌萎縮是最常見的肺外組織改變[3]。前期研究顯示，COPD大鼠肌肉生長抑制素（myostatin）含量顯著增加，能夠促進肌肉萎縮，而骨骼肌萎縮的發生可能與COPD肺部炎癥及全身性炎癥反應有關[4]。筆者推測香煙煙霧成分升高骨骼肌細胞myostatin含量，引起炎癥反應，導致骨骼肌萎縮和功能障礙。本研究采用香煙煙霧處理小鼠C2C12成肌細胞，觀察myostatin表達和炎癥反應情況，并探討myostatin在骨骼肌炎癥反應中的作用，為COPD骨骼肌萎縮的防治提供新的思路和實驗依據，現報道如下。

1材料與方法

1.1材料

小鼠成肌細胞C2C12細胞（中科院上海細胞庫），芙蓉牌香煙（焦油12 mg/支）（湖南中煙工業有限責任公司），DMEM培養基和胎牛血清（Gibco），MTT試劑（Sigma），Lipofectamine 3000和TRIzol（Invitrogen），逆轉錄試劑盒和Real-time PCR檢測試劑盒（Takara），BCA蛋白定量試劑盒（WellBiology），ECL發光液（Pierce），兔抗myostatin多克隆抗體（Proteintech），GAPDH抗體、IL-8和TNF-α ELISA試劑盒（博士德），myostatin siRNA（GCGGATGGCAAGCCCAAATT，吉瑪生物）。

1.2方法

1.2.1香煙煙霧提取物制備 參照文獻方法并加以改良[5]。將1支芙蓉牌香煙去濾嘴燃燒5 min的煙霧通過注射器連續抽吸溶于10 ml 37℃預熱的DMEM中，過濾除菌后作為100%的CSE原液，分別配置1.0%、2.5%、5.0%和10.0%的CSE工作液，1 h內用于實驗。

1.2.2 MTT檢測 以5000個細胞/孔接種于96孔板，分別給予0.1%、2.5%、5.0%和10.0%的CSE處理48 h，每組6個復孔，依照MTT說明書進行操作，檢測不同濃度CSE處理后C2C12細胞生長情況。

1.2.3細胞干預和分組 以105個細胞/孔接種于24孔板，實驗分為4個組，分別為對照組、5% CSE組、myostatin-siRNA組、5% CSE+myostatin-siRNA組。處理48 h，每組6個復孔，收集細胞上清用于ELISA分析，收集細胞用于mRNA或蛋白表達分析。

1.2.4 Real-time PCR檢測 C2C12細胞按照TRIzol法提取總RNA，依照試劑盒操作逆轉成cDNA。使用ABI7500實時熒光定量PCR進行PCR擴增，引物序列見表1。反應體系20 μl，擴增條件為95℃、30 s，95℃、5 s，60℃、30 s，共40個循環。按照2-ΔΔCT法[6]計算各組myostatin的相對表達量。

1.2.5 Western blot檢測 C2C12細胞按照RIPA裂解法提取總蛋白，BCA試劑盒定量后取30 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別以myostatin抗體（1∶1000）和GAPDH抗體（1∶1000）孵育過夜后，二抗（1∶5000）孵育1 h，ECL化學發光顯影。

1.2.6 ELISA檢測 C2C12細胞上清收集后，通過ELISA方法測定IL-8和TNF-α含量，具體操作步驟依照試劑盒說明書進行。

1.3統計學處理

采用SPSS 20.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較選用最小顯著性差異法（LSD），以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1不同濃度CSE對小鼠C2C12細胞增殖的影響

CSE處理小鼠C2C12細胞48 h，與對照組吸光值1.21±0.13相比，1.0%和2.5% CSE組平均吸光度值為1.15±0.09和1.11±0.15，無明顯變化，細胞增殖無明顯影響（P>0.05）；5%和10% CSE平均吸光度均為0.92±0.17，明顯降低，細胞增殖被明顯抑制（P<0.05）（圖1）。后續實驗選用5% CSE進行處理。

2.2各組細胞myostatin mRNA的表達水平分析

Real-time PCR檢測結果顯示，5% CSE組的C2C12細胞myostatin mRNA表達水平為1.32±0.15，顯著高于對照組的1.00（P<0.05）；myostatin-siRNA組的C2C12細胞myostatin mRNA表達水平為0.61±0.19，低于對照組（P<0.05）；5% CSE+myostatin-siRNA組的C2C12細胞myostatin mRNA表達水平為0.92±0.13，低于5% CSE組（P<0.05）（圖2）。

2.3各組細胞myostatin 蛋白的表達水平分析

Western blot檢測結果顯示，5% CSE組的C2C12細胞myostatin蛋白表達水平為1.40±0.11，顯著高于對照組的1.00（P<0.05），myostatin-siRNA組的C2C12細胞myostatin蛋白表達水平為0.52±0.17，低于對照組（P<0.05），5% CSE+myostatin-siRNA組的C2C12細胞myostatin蛋白表達水平為0.93±0.15，低于5% CSE組（P<0.05）（圖3）。

2.4各組細胞炎癥介質表達水平

ELISA檢測結果顯示，5% CSE組C2C12細胞上清中的IL-8和TNF-α含量分別為835.83±47.30和218.83±27.09，顯著高于對照組（P<0.05）；myostatin-siRNA組C2C12細胞上清中的IL-8和TNF-α含量分別為510.17±49.15和110.67±12.60，與對照組比較差異無統計學意義（P<0.05）；5% CSE+myostatin-siRNA組C2C12細胞上清中的IL-8和TNF-α含量分別為709.83±111.75與162.17±23.52，低于5% CSE組（P<0.05）（圖4）。

3討論

目前，COPD已經成為全球第四大致死性疾病，每年受COPD困擾的患者多達6億。全球30歲以上人群中，COPD的患病率從1990年的10.7%上升到2010年的11.7%[7]。2013年全球疾病負擔（GBD 2013）報告指出，COPD導致的死亡人數從1990年的242.13萬上升至2013年的293.12萬，約占全球死亡人數的6%，成為全球第三大致死性疾病[8]。在發達國家，COPD是增長最為迅速的死因之一，在心腦血管疾病病死率大幅下降的同時，COPD的死亡率卻增加了163%[9]。隨著發展中國家吸煙率的增加和高收入國家的老齡化，COPD的發病率預計在未來30年內將上升，預計到2030年將有超過450萬人死于COPD和相關疾病，死亡人數將接近全球死亡總數的8.5%，成為全球第3位死因疾病。近年來，我國COPD發病率呈上升趨勢?！吨袊用駹I養與慢性病狀況報告（2015年）》指出，我國40歲及以上人群中COPD患病率為9.9%。張榮葆等[10]針對中國已發表的19項COPD大型流行病學調查資料（2000年1月～2011年12月）分析后，發現中國各地40歲以上人群COPD患病率為6.0%～15.4%。

吸煙是COPD發生、發展過程中最重要的危險因素，香煙煙霧成分能導致肺部乃至全身異常的炎癥反應，引起肺癌組織如骨骼肌、心血管等病變，加重COPD的進展[11]。骨骼肌是COPD受累最主要的肺外組織，研究顯示，吸煙能導致蛋白合成減少和降解增多，從而導致骨骼肌消耗[12]。此外，香煙煙霧成分能使肺部產生過多的炎癥介質（如IL-8和TNF-α）并釋放到循環中，參與骨骼肌萎縮的發生[13]。在骨骼肌的消耗及功能障礙過程中，肌肉生長抑制素受到廣泛關注，其主要作用為抑制肌肉的生長發育，在肌肉消耗性疾病中表達增高[14]。前期研究已證實，COPD大鼠myostatin含量顯著增加，而其在骨骼肌炎癥中的作用如何尚未查見相關文獻報道。

本研究結果顯示，CSE處理小鼠成肌細胞C2C12后細胞myostatin表達增加，炎癥介質釋放增多；而用myostatin-siRNA沉默myostatin基因后再用CSE處理細胞，myostatin表達增加程度受到抑制，炎癥介質釋放減少。這提示CSE處理能誘導myostatin表達，沉默myostatin基因后，CSE促進炎癥介質釋放的作用受到限制，而單純的myostatin基因沉默并不影響細胞炎癥介質的釋放，提示myostatin并不直接參與炎癥反應的上游調控，而在CSE刺激后，抑制myostatin能夠反饋性的減少CSE所致的炎癥反應，因此，CSE可導致myostatin水平升高，骨骼肌消耗和萎縮，炎癥反應加重，與COPD呈正相關。myostatin沉默后，骨骼肌消耗和萎縮減少，能夠對抗CSE所致的炎癥反應，緩解COPD[15]。香煙煙霧成分誘導炎癥介質產生后，可以通過促進蛋白分解和抑制蛋白合成來誘導骨骼肌消耗[16]，同時活化p38和ERK的MAPK信號，應用p38和ERK的抑制劑能夠消除肌肉萎縮和肌球蛋白降解[17]，而吸煙者肌肉蛋白合成降低主要與myostatin表達增加有關，myostatin通過抑制Akt的活化，阻礙蛋白合成的啟動和細胞更新而抑制肌肉生長[18]，同時香煙煙霧成分能減低肌肉中活化的Akt，并損害肌肉細胞的分化能力[19]。早期研究顯示，COPD患者的運動功能受限主要歸因于其肺功能受損，而近年來的研究發現，許多肺功能受損不明顯的患者也存在運動功能異常[20]，而干預myostatin來改善骨骼肌功能障礙對于更好地防治COPD炎癥反應和疾病演變，改善預后，提高生活質量可能有著重要的價值。

綜上所述，通過小鼠C2C12成肌細胞體外培養模型，觀察香煙煙霧提取物對myostatin表達和炎癥反應的影響，并通過沉默myostatin表達觀察炎癥反應的改變，并將myostatin作為研究重點，為COPD骨骼肌萎縮和炎癥反應的防治提供新的思路和實驗依據。

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（收稿日期：2017-08-29 本文編輯：祁海文）