瑪咖多肽的制備及抗氧化活性研究

梁姝敏,吳正奇,*,許 琦,張云天,余 攀

(1.湖北工業大學生物工程與食品學院,湖北武漢 430068;2.湖北工業大學土木建筑與環境學院,湖北武漢 430068)

瑪咖(Maca,LepidiummeyeniiWalp.)是一種十字花科(Brassicaceae)獨行菜屬(Lepidium)一年生藥食兩用草本植物,在增強生育力、提高精力、抗疲勞和改善內分泌等方面負有盛名[1-4]。瑪咖含有蛋白質、氨基酸、礦物質等營養成分,還含有瑪咖酰胺、瑪咖烯、芥子油苷、綠原酸以及甾醇等活性成分[3]。其中瑪咖含有18種氨基酸,其中必需氨基酸占總氨基酸的36.75%。瑪咖蛋白質含量豐富,含量為10.2%～18%[5]。

大量的研究表明,多肽具有免疫調節、神經調節、降膽固醇和降血脂、降血壓、抑菌以及抗氧化等方面的功能[6-9]。提取多肽常用的手段有分離提取法、化學合成法、基因重組法、水解法和微生物發酵法[10]。然而目前關于瑪咖多肽報道僅有羅彤[11]采用堿溶酸沉法提取瑪咖蛋白質后酶解制備瑪咖多肽,并對瑪咖多肽的抗疲勞活性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瑪咖干粉 產自新疆瑪咖種植基地的黃瑪咖干燥磨粉過40目篩;酸性蛋白酶(酶活力5×104U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力5×104U/g) 南寧東恒華道生物技術有限公司;中性蛋白酶(酶活力2×106U/g) 武漢市華順生物技術有限公司;堿性蛋白酶(酶活力1.6×105U/g) 諾維信生物技術有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;抑制與產生超氧陰離子自由基測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。實驗室常用有機試劑和無機試劑,無特殊說明均為國產分析純或國產標準品。

HYP-308消化爐、KDN-102F自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;SYZ-B型石英亞沸高純水蒸餾器 常州國華電器有限公司;UV-6100雙光束型紫外可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司;ST2100 pH計 奧豪斯儀器有限公司;TDL-5-A離心機 上海安亭科學儀器廠;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 瑪咖醇提液的制備 工藝流程:稱取瑪咖干粉→料液比1∶10 (g∶mL)55%乙醇85 ℃回流提取1 h,提取兩次→3500 r/min×10 min離心分別收集上層液體和下層沉淀,上層液體即為瑪咖醇提液

瑪咖多肽的制備工藝流程:取上述工藝中得到的下層沉淀→適量水溶解→95 ℃,高溫α-淀粉酶酶解2 h→5000 r/min×15 min離心得到瑪咖粗蛋白沉淀→少量水洗滌沉淀→復溶于水→蛋白酶酶解→煮沸滅酶→5000 r/min×15 min離心取上層瑪咖多肽水相→真空冷凍干燥,凍干物即為瑪咖多肽。

1.2.2 水解最適酶的選擇 以水解度為指標,測定相同加酶量下的不同種類酶(酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶)對瑪咖粗蛋白水解程度的影響,確定最適宜的蛋白酶,參考文獻[10]加酶量為8×103U/g。參考每種酶的產品說明書,對應的最適酶解pH及酶解溫度見表1。蛋白質含量的測定采用食品中蛋白質的測定方法——凱氏定氮法GB5009.5-2010。蛋白質水解度測定采用甲醛滴定法[12]。

表1 不同種類酶作用的條件Table 1 Conditions of different enzymes

1.2.3 酶解條件優化的單因素實驗 最適酶分別在酶解時間0.5、1、2、3、4 h,酶解pH10,酶解溫度50 ℃,加酶量8×103U/g條件下,探究酶解時間對瑪咖粗蛋白的水解度影響。最適酶分別在酶解時間2 h,酶解pH9、9.5、10、10.5、11,酶解溫度50 ℃,加酶量8×103U/g條件下,探究酶解pH對瑪咖粗蛋白的水解度影響。最適酶分別在酶解時間2 h,酶解pH10,酶解溫度40、45、50、55、60 ℃,加酶量8×103U/g條件下,探究酶解溫度對瑪咖粗蛋白的水解度影響。最適酶分別在酶解時間2 h,酶解pH10,酶解溫度50 ℃,加酶量3.2×103、6.4×103、9.6×103、1.28×104、1.6×104U/g條件下,探究加酶量對瑪咖粗蛋白的水解度影響。所有實驗組別均按照1.2.1所述工藝進行。

1.2.4 酶解條件優化的正交實驗 在單因素實驗的基礎上,設計4因素3水平正交實驗,因素水平設計見表2,優化瑪咖多肽提取工藝條件。選取加酶量、酶解時間、酶解溫度和酶解pH 4個因素,設計9組不同組合實驗,從中篩選出最佳提取條件。

表2 酶解瑪咖粗蛋白的正交實驗設計Table 2 Design of orthogonal experiment of enzymolysis on Maca protien

1.2.5 瑪咖多肽純度的測定

瑪咖多肽純度(%)=(瑪咖多肽凍干粉蛋白質量/瑪咖凍干粉質量)×100

式(1)

1.2.6 瑪咖多肽抗氧化能力的測定

1.2.6.1 OH·清除能力的測定(Fenton法) 將配制好的一定濃度梯度的待測液2 mL分別置于10 mL比色管中(取一份蒸餾水作空白對照),加入5 mmol/L FeSO4和5 mmol/L H2O2各2 mL,搖勻,迅速加入2 mL 5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液,立即置于37 ℃水浴保溫60 min后,于510 nm處測定吸光值。

OH·清除率(%)=100%×[1-(Aj-Ai)/A0]

式(2)

式(2)中,A0-2 mL FeSO4+2 mL H2O2+2 mL水楊酸-乙醇+2 mL蒸餾水的吸光值;Ai-2 mL待測液+2 mL水楊酸-乙醇+4 mL蒸餾水的吸光值;Aj-2 mL待測液+2 mL FeSO4+2 mL H2O2+2 mL水楊酸-乙醇的吸光值。

1.2.6.2 DPPH自由基清除能力的測定 將配制好的一定濃度梯度的待測液4 mL分別置于10 mL比色管中(取一份蒸餾水作空白對照),加入4 mL 0.1 mmol/L DPPH·乙醇溶液,混勻后避光30 min,于517 nm波長測定其吸光值。

DPPH·清除率(%)=[1-(Bj-Bi)/B0]×100

式(3)

式(3)中,B0-4 mL DPPH·乙醇溶液+4 mL蒸餾水的吸光值;Bi-4 mL待測液+4 mL DPPH·乙醇溶液的的吸光值;Bj-4 mL待測液+4 mL無水乙醇的吸光值。

式(4)

式(4)中,C0-對照管的吸光值;Ci-測定管的吸光值。

1.2.7 瑪咖多肽的氨基酸組成分析 按照國家標準GB/T 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》測定瑪咖多肽的氨基酸組成。

1.3 數據分析

實驗分析的數據是三組平行實驗的均值±標準差,采用軟件OriginPro 8進行數據分析計算及繪圖。

2 結果與分析

2.1 酶種類的選擇

在酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶各自最適反應條件下,測定四種酶對瑪咖粗蛋白的水解度。結果如圖1,水解度分別6.51%,8.30%,18.67%,6.32%。其中,堿性蛋白酶對瑪咖粗蛋白的水解程度最大,說明堿性蛋白酶是酶解瑪咖粗蛋白的最適宜的酶。

圖1 不同酶作用下瑪咖粗蛋白的水解度Fig.1 Maca protein DH hydrolyzed by different enzyme

2.2 酶解的單因素實驗

2.2.1 酶解溫度對水解度的影響 由圖2可以看出,隨著酶解溫度的提高,水解度呈現先增加后減小的趨勢。當溫度在40 ℃升至50 ℃時,水解率隨溫度的升高而增加;在50 ℃時,水解度到達最大值,為18.67%;當溫度繼續升高至60 ℃時,水解度減小。所以,最優酶解溫度為50 ℃。分析原因:當溫度低時,酶活性隨著溫度增加而增加,當溫度達到酶解的最適溫度時酶活性最強。隨著溫度持續升高至超過最適溫度,酶可能會失活,所以酶活降低,水解度減小[13]。

圖2 不同酶解溫度下瑪咖粗蛋白的水解度Fig.2 Maca protein DH hydrolyzed by different temperature

2.2.2 pH對水解度的影響 由圖3可以看出,水解度隨著pH的增大,呈現先增大后減小的趨勢。當pH從9增大至10時,水解度不斷增大;在pH10時達到最大值為18.55%;當pH繼續增大至11時,水解度逐漸減小。所以,最優pH為10。分析原因:pH會影響堿性蛋白酶及蛋白質分子某些基團的解離狀態,從而導致堿性蛋白酶活性降低。

圖3 不同酶解pH下瑪咖粗蛋白的水解度Fig.3 Maca protein DH hydrolyzed by different pH

2.2.3 加酶量對水解度的影響 由圖4可以看出,隨著加酶量的增加,水解度先大幅增加后趨于平緩。當加酶量為1.6×104U/g時,水解度達到最大值,為22.48%。所以,最優加酶量為1.6×104U/g。分析原因:隨著加酶量增加,酶解速率加快,對底物消耗更快;達到一定值時,底物幾乎被完全酶解。此種情況下,再加大加酶量對底物的水解度影響不大。

圖4 不同加酶量下瑪咖粗蛋白的水解度Fig.4 Maca protein DH hydrolyzed by different ratio of enzyme

2.2.4 酶解時間對水解度的影響 由圖5可知,水解度隨著時間的增加而增大,最后基本穩定在一定的水平。所以,最優酶解時間為4 h。分析原因:隨著時間的延長,底物不斷地被酶解消耗,因此水解率也在不斷地增加。當底物被完全水解后,水解度便不再增加。

圖5 不同酶解時間下瑪咖粗蛋白的水解度Fig.5 Maca protein DH hydrolyzed by different time

2.3 酶解的正交實驗

按照表2中數據進行L9(34)正交實驗,對瑪咖多肽的水解條件進行優化,考察加酶量、酶解溫度、酶解pH以及酶解時間4個因素對水解度的影響,結果見表3。由表3可以看出影響水解度的各因素有主到次的排序分別為酶解時間、酶解pH、酶解溫度、加酶量。最優酶解組合為A3B3C3D3,即加酶量1.6×104U/g、酶解時間4 h、酶解溫度55 ℃、酶解pH為10.5,在此條件下,做三組平行實驗,水解度最高,為(31.55%±0.74%)。采用凱氏定氮法分析,最適條件下提取后凍干得到瑪咖多肽純度為54.71%。

表3 酶解瑪咖粗蛋白正交實驗的結果與分析Table 3 Results of orthogonal experiment of enzymolysis on Maca protein

2.4 瑪咖醇提液抗氧化活性測定

圖6 瑪咖醇提液的抗氧化能力Fig.6 Antioxidant activity of Maca alcohol

2.5 瑪咖多肽抗氧化活性測定

2.5.1 瑪咖多肽對·OH的清除能力 不同濃度的瑪咖多肽液(在最適條件條件下獲得)和VC溶液對·OH清除能力如圖7所示。從圖中可以看出,瑪咖多肽對·OH的清除能力隨濃度增加而增加,在濃度為2 mg/mL時,對·OH的清除率最大,為89.56%。VC溶液在濃度為1.5 mg/mL時對·OH的清除率最大,為99.81%。瑪咖多肽和VC溶液清除·OH的IC50值分別為0.85和0.44 mg/mL。

圖7 瑪咖多肽對羥自由基的清除能力Fig.7 OH· radical scavenging ability of Maca peptide

2.5.2 瑪咖多肽對DPPH自由基的清除能力 不同濃度的瑪咖多肽(在最適條件下獲得)和VC溶液對DPPH自由基清除能力如圖8所示。從圖中可以看出濃度高于0.5 mg/mL時,二者對DPPH自由基的清除率基本都保持不變。瑪咖多肽在濃度為0.5 mg/mL時對DPPH自由基的清除率最大,為79.04%。瑪咖多肽和VC溶液清除DPPH自由基的IC50值分別為0.44和0.32 mg/mL。二者對DPPH自由基都具有明顯的清除作用。

圖8 瑪咖多肽對DPPH自由基的清除能力Fig.8 DPPH radical scavenging ability of Maca peptide

圖9 瑪咖多肽對超氧陰離子自由基的清除能力 radical scavenging ability of Maca peptide

2.6 瑪咖多肽的氨基酸組成分析

對瑪咖多肽進行氨基酸組成分析,實驗結果見表4。由表4可知,瑪咖多肽含有17種氨基酸(不包含色氨酸),其中,必需氨基酸占總氨基酸含量的37.50%。構成肽的氨基酸種類和數量影響著多肽的抗氧化能力的大小。許多氨基酸及其衍生物有清除自由基的能力,如:Lys、His、Tyr、Met、Pro、Arg、Glu、Cys等,而且含有Tyr、His、Lys、Pro等氨基酸的多肽一般具有較強的抗氧化活性[17]。此外,多肽的氨基酸排列對其抗氧化活性也具有一定影響,如:His-His的N末端增加一個Leu或Pro能夠增強二肽的抗氧化活性和促進與非肽類抗氧化劑的協同作用[18]。瑪咖多肽中Tyr、His、Lys、Pro四種氨基酸含量為16.98%,可以推斷,瑪咖多肽具有較強的抗氧化能力可能與其含有的這些氨基酸有關。但其具體的分子質量分布及氨基酸排列,仍需要進一步分離純化后確定。

表4 瑪咖多肽的氨基酸組成及含量Table 4 Amino acid composition of Maca peptide

3 結論

抗氧化活性肽能夠清除自由基、終止單線態氧的生成、螯合促氧化的過渡金屬離子,而且因為分子量小，易于消化吸收[19],因此,對瑪咖多肽的研究為天然抗氧化劑和功能食品領域提供了新的可能。

[1]Lee MS,Shin BC,Yang EJ,et al. Maca(Lepidiummeyenii)for treatment of menopausal symptoms:A systematic review[J]. Maturitas,2011,70(3):227-233.

[2]Pino-Figueroa A,Nguyen D,Maher TJ. Neuroprotective effects of Lepidium meyenii(Maca)[J]. Ann NY Acad Sci,2010,1199:77-85.

[3]金航,李宏,李晚誼.功能性食品瑪咖研究進展[J].食品研究與開發,2015,36(24):182-186.

[4]Myeong Soo Lee,Hye Won Lee,Sooseong You,et al. The use of maca(Lepidiummeyenii)to improve semen quality:A systematic review[J]. Maturitas,2016,92:64-69.

[5]金文聞.藥食兩用植物瑪咖(Lepidium meyenii)的功效物質研究[D].武漢：華中科技大學,2006.

[6]任文華,張雙全,宋大樣,等.少棘娛蟻抗菌肽粗品對小鼠巨噬細胞的體外激活作用[J].中藥材,2007,30(12):1491-1494.

[7]鄒吉利,徐南平.中藥活性多肽研究進展[J].湖北中醫藥大學學報,2012,14(4):66-67.

[8]玄國東.米糟蛋白提取及酶法制備抗氧化活性肋及降血壓活性肽的研究[D].杭州:浙江大學,2005.

[9]劉昭明,黃翠姬,周遠.核桃蛋白酶水解物的抑菌性能探討[J].四川食品與發酵,2008,44(5):20-23.

[10]郝常艷.核桃多肽的制備條件優化及其抗氧化活性研究[D].太原：山西大學,2014,6.

[11]羅彤,朱學良,葉偉,等.瑪咖多肽對運動小鼠抗疲勞作用的研究[J].中國食品工業,2010(11):65-66.

[12]周慧江,朱振寶,易建華.核桃蛋白水解物水解度測定方法比較[J].糧食與油脂,2012(2):28-30.

[13]張超,唐志紅,趙振軍,等.堿性蛋白酶水解扇貝邊條件的優化[J].食品科技,2015,40(1):162-165.

[14]蘭玉倩,樊丹敏,呂俊梅,等.瑪咖保健酒中總多酚含量的測定研究[J].中外食品工業,2013(9):10-11.

[15]杜廣香.瑪咖生物堿的分離純化及抗氧化活性研究[D].廣州:華南理工大學,2011.

[16]Shenghua Zha,Qingsheng Zhao,Jinjin Chen,et al. Extraction,purification and antioxidant activities of the polysaccharides from maca(Lepidium meyenii)[J].Carbohydrate Polymers,2014(111):584-587.

[17 劉慧,馮志彪.抗氧化肽的研究進展[J].農產品加工,2009(7):64-67.

[18 Kitts D D,Weiler K. Bioactive proteins and peptides from food sources. applications of bioprocesses used in isolation and recovery[J].Current Pharmaceutical Design,2003,9(16):1309-1323.

[19]范三紅,王亞云,胡雅喃,等.南瓜籽蛋白酶解液的超濾分離及其抗氧化活性研究[J].食品工業科技,2012,33(20):128-132.