食品中單核細胞增生李斯特氏菌兩種定量檢測方法的比較

馬慧娟,徐 慧,李俐俐,劉 姝,賈 濤,李新麗,高 宏,張厚森

(江蘇省理化測試中心,江蘇南京 210046)

單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes,LM)是唯一能引起人畜共患病的主要致病菌,由于該菌具有耐高鹽、高滲透壓、低溫和低水分的特點,因此其可在極端條件下生長且很難在食物鏈中被清除[1]。2002年,LM已被 WHO 列為四大重要的食源性致病菌之一[2]。據報道,近年來由LM引發的病例呈上升趨勢[3-6],且由該菌感染引起的食物中毒導致的人畜患胃腸炎、腦膜炎、敗血癥以及流產和死胎等疾病的死亡率高達30%～70%[7-8]。隨著人們生活節奏的加快,冷藏、速凍食品的消費量也迅速增加,但該類食品被LM感染會持續腐敗[9],因此冷藏類食品的微生物檢測必須引起重視。

目前,國內外對LM的檢驗方法主要包括傳統培養檢測和快速檢測兩大類,前者包括國際上的FDA-BAM、ISO 11290 等方法[10]。我國常用的是國標法,自1994年(GB/T4789.30-1994)發布以來一直作為食品衛生中LM檢測的主要依據,截止2017年該法已進行了4次修訂(GB/T4789.30-2003、GB/T 4789.30-2008、GB 4789.30-2010和GB 4789.30-2016),其中,與GB 4789.30-2010相比,GB 4789.30-2016《單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》增加了“第二法 單核細胞增生李斯特氏菌平板計數法”和“第三法 單核細胞增生李斯特氏菌MPN 計數法”,進一步滿足了LM的計數要求,并且方法的可操作性得到很大提升,有利于基礎條件相對薄弱的實驗室開展檢測。快速檢測法包括酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、酶聯熒光分析法(ELFA)和側流免疫法(Lateral Flow Immunoassay)等免疫學方法、生物傳感器法、基于噬菌體的檢測法及多重PCR、實時熒光PCR、核酸探針雜交技術和恒溫擴增技術等分子生物學方法[11]。與傳統的檢測方法相比,免疫學方法具有速度快、可重復性好;生物傳感器法響應時間慢,壽命短且靈敏度不高;而分子生物學方法檢測快速、可重復性強、且可同時設置多參數檢測,并能夠實現自動化,但快速檢測方法存在特異性低、檢測結果假陽性率偏高、成本高等缺點,因此在食品衛生微生物的實際檢驗中,各單位部門和食品檢測中心仍以傳統培養檢測方法為主。

本研究通過比較平板計數(Plate counting)法和稀釋培養計數(Most probable number counting,MPN)法測定人工污染不同雜菌和LM的不同種類食品中LM的檢出率而篩選出最佳檢測方法,并比較不同食品在不同儲存條件下LM的數量，進而探討食品冰箱保存的最佳保存時間和方法,為家庭冰箱食品的保存條件提供參考性的建議。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

牛奶、涼拌菜和鹽水鴨 采自南京市某超市,采集當天進行樣品檢測；單核細胞增生李斯特氏菌CICC21633和金黃色葡萄球菌(StaphylococcusAureus,SA)CICC21600 中國工業微生物菌種保藏管理中心;大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli)25922 廣東省食品微生物安全工程技術研究中心。

拍擊式均質器 HBM-400B中國天津;李氏增菌肉湯(LB肉湯，批號：3105131)、李斯特氏菌顯色培養基(批號：6103134)、李氏增菌液LB1(批號：6105150)、LB2配套試劑(批號：6105236)、PALCAM 瓊脂(批號：3104527)、含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE，批號：3105514)、LM生化鑒定試劑盒(批號：5105133) 廣東環凱生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試樣的制備及檢測 將從南京市某超市采集的牛奶、涼拌菜和鹽水鴨樣品當天立即按照GB 4789.30-2016中的第一法進行定性檢測,檢測結果為LM陰性。樣品的平板計數法和MPN計數法采用GB 4789.30-2016 中的第二法和第三法[13]。

1.2.2 菌種數量的獲取 將LM、E.coli和SA分別接種于營養肉湯中,其中E.coli和SA混合接種于一份營養肉湯中,(36±1) ℃培養24 h;取1 mL菌液與9 mL的生理鹽水混勻,10倍倍比稀釋,進行平板計數[12],計數方法同GB 4789.2-2016[14]。

1.2.3 模擬雜菌含量低污染試樣的檢測 取LM檢測均為陰性的牛奶、涼拌菜(在無菌條件下剪碎)和鹽水鴨(在無菌條件下剪碎)試樣,于沸水中煮10 min,每個樣品分為平行4份,3份接種菌液,根據菌液濃度取不同的量分別加入含有25 mL牛奶、25 g涼拌菜和25 g鹽水鴨的225 mL的LB肉湯中,使LM的終濃度分別約為600、100和20 CFU/mL,同時使E.coli和SA的數量之和分別約為60、10和2 CFU/mL,使目標菌(LM)和雜菌(E.coli和SA)數量比例約為10∶1,另1份不接菌,作為陰性對照。每個濃度做3個獨立重復實驗。

上述目標菌和雜菌的數量均為在做樣品的同時取一定量的樣品進行平板計數的結果,即取每個濃度的樣品25 g(mL)分別加入225 mL LB增菌液和無菌生理鹽水中,按照GB 4789.30-2010(第二法)、GB 4789.3-2016(第二法)[15]和GB 4789.10-2016(第二法)[16]分別做平板計數,計算LM、E.coli和SA的具體數量。

1.2.4 模擬雜菌含量高污染試樣的檢測 取LM檢測均為陰性的牛奶、涼拌菜(在無菌條件下剪碎)和鹽水鴨(在無菌條件下剪碎)試樣,在沸水中煮10 min,每個樣品分為平行4份,3份接種菌液,根據菌液濃度取不同的量分別加入含有 25 mL牛奶、25 g涼拌菜和25 g鹽水鴨的225 mL的LB肉湯中,使LM的終濃度分別約為600、100和20 CFU/mL,同時使E.coli和SA的數量之和分別約為6000、1000和200 CFU/mL,使目標菌(LM)和雜菌(E.coli和SA)數量比例約為1∶10,另1份不接菌,作為陰性對照。每個濃度做3個獨立重復實驗。加目標菌和雜菌的數量計算方法同1.2.3。

1.2.5 冷凍和冷藏保藏污染試樣的檢測 取若干滴LM菌液加入牛奶、涼拌菜和鹽水鴨中,混勻,分成2份,分別置于2～8 ℃和-20 ℃的冰箱中保存,取保存3、5、7 d的樣品用MPN計數法進行測定。

1.3 統計方法

采用Excel 2003軟件建立數據庫,運用SPSS 17. 0統計軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 無雜菌的染菌實驗

無雜菌的不同食品染菌試樣檢測結果見表1,牛奶、涼拌菜和鹽水鴨試樣的染菌實驗表明,平板計數法和MPN計數法測得的LM結果均接近于染菌的起始濃度。結果相差不超過0.5倍,結果均小于1個數量級。不同種類食品不同染菌量平板計數法測得的LM結果是初始染菌量的0～0.05倍,MPN計數法測得的LM結果是初始染菌量的0～0.5倍,在無雜菌污染時,平板計數法比MPN計數法的準確度更高一些。

表1 無雜菌的不同食品染菌實驗中LM的檢測結果Table 1 Detection results of LM in different foods contamination tests with non content of miscellaneous bacterium

2.2 雜菌含量低的染菌實驗

模擬雜菌含量低的試樣檢測結果見表2,牛奶、涼拌菜和鹽水鴨試樣的染菌實驗表明,平板計數法測得的LM結果接近于染菌的起始濃度,結果相差0.6～1.2倍,小于1個數量級,其中鹽水鴨試樣測得的LM結果與染菌的起始濃度最接近,結果最高相差1.1倍;涼拌菜試樣測得的LM結果與染菌的起始濃度相差0.9～1.1倍;牛奶試樣測得的LM結果與染菌的起始濃度相差最大,結果相差0.6～1.2倍,試樣除鹽水鴨外,結果表明,LM染菌濃度越小(<100 CFU/g(mL)),檢測菌量與染菌量的結果相差越大。MPN計數法檢測LM結果遠高于染菌的起始濃度,結果相差1.2～18倍,其中鹽水鴨試樣測得的LM結果與染菌的起始濃度相差最大,結果相差2.2～18倍;涼拌菜試樣測得的LM結果與染菌的起始濃度相差最小,結果相差1.2～3.9倍;牛奶試樣測得的LM結果與染菌的起始濃度相差2.2～7.5倍;所有試樣檢測結果表明LM染菌濃度越小(<100 CFU/g(mL)),檢測菌量結果與染菌量的結果相差越小。

表2 雜菌含量低的不同食品染菌實驗中LM的檢測結果Table 2 Detection results of LM in different foods contamination tests with low content of miscellaneous bacterium

2.3 雜菌含量高的染菌實驗

模擬雜菌含量高的試樣檢測結果見表3。牛奶、涼拌菜和鹽水鴨試樣的染菌實驗表明,平板計數法檢測LM結果遠低于染菌的起始濃度,結果相差0.5～0.8倍,與雜菌含量低的平板計數法測得的0.6～1.2倍相比,測量結果的準確性略有降低。其中涼拌菜試樣測得的LM結果與染菌的起始濃度相差最大,結果相差0.5～0.8倍;鹽水鴨和牛奶試樣測得的結果與染菌的起始濃度相差相對較小,結果相差0.6～0.8倍;且LM染菌的初始濃度越高(≥100 CFU/g(mL)),檢測菌量與初始濃度相差越小。MPN計數法測得的LM結果與染菌的起始濃度相比,結果相差1.1～2.5倍,與雜菌含量低的MPN計數法測得的1.2～18倍相比,測量結果的準確性提高約7倍。其中鹽水鴨試樣測得的LM結果與染菌的起始濃度最接近,結果相差1.1～2.0倍;涼拌菜試樣測得的LM結果與染菌的起始濃度相差1.4～1.8倍;牛奶試樣測得的結果與染菌的起始濃度相差最大,結果相差1.5～2.5倍,且LM染菌的初始濃度越高(≥100 CFU/g(mL)),結果相差越大。

2.4 冷藏前后試樣中單增李斯特氏菌數量的變化

由表4結果可知,2～8 ℃保存后的3種試樣中LM的數量隨著保存時間的增加均有不同程度的增加。牛奶樣在保存3 d后LM的數量增長最多,比初始結果增加了4倍,之后增長速度減慢,7 d時增加了10.6倍;涼拌菜中的增長速度最慢,保存3、5 和7 d的LM數量分別增加了1.3、2.1和3.2倍;鹽水鴨中的LM增長速度最快,3 d增加了2.6倍,5 d時增長量與牛奶中的相同,增加了6.4倍,7 d時的增長量為初始菌量的26倍。牛奶、涼拌菜和鹽水鴨在經過不同冷藏保存時間后LM數量對比差異有統計學意義(p<0.05)。由于涼拌菜的初始染菌量與牛奶和鹽水鴨不同,無法比較經過相同保存天數后的不同種類食品中LM數量增長是否有差異,但根據表4結果可知,LM的增長速度:涼拌菜<牛奶<鹽水鴨。

表4 冷藏保存時間對LM數量變化的影響Table 4 The effect of storage time on the variation of LM

2.5 冷凍前后試樣中單增李斯特氏菌數量的變化

表5結果顯示-20 ℃保存后的試樣中LM的數量均有不同程度的增加。牛奶和涼拌菜冷凍3 d后,LM的數量與初始量相比無變化或變化很小,數量差異不具統計學意義(p<0.05),而鹽水鴨中的LM數量增加了3倍,與初始對比差異顯著(p<0.05)。冷凍保藏過程中,LM的數量在涼拌菜中的增長速度最慢,而鹽水鴨中LM的數量增長最快;牛奶、涼拌菜和鹽水鴨中LM數量在5 d時分別增長了11.9、3.2和11.9倍,而7 d時增長量分別為25.8、10.4和42倍,三種食品的LM數量在3與5、5與7 d及分別與初始水平相比均有統計學意義(p<0.05)。

三種食品分別在冷藏和冷凍條件下保存到7 d時,LM的數量均大幅度增加,尤其是鹽水鴨中的增長量最大,推測熟肉中的蛋白質、維生素等營養物質含量高而有利于LM的生長。由于涼拌菜的初始染菌量與牛奶和鹽水鴨不同,無法比較不同種類的食品在同樣的保存天數LM數量增長是否有差異,但由表5中的結果可知,LM增長的速度:涼拌菜<牛奶<鹽水鴨,與冷藏條件下LM食品種類增長一致。

表5 冷凍保存時間對LM數量變化的影響Table 5 The effect on the variation of LM with time of forzen storage

3 結論

本文研究結果對比表明,在LM污染水平較高(≥100 CFU/g(mL))，雜菌含量低(LM含量與雜菌含量比為10∶1)的情況下，平板計數法優于MPN計數法,因此對食品中LM的定量檢測較為適用,而在LM污染水平較低(<100 CFU/g(mL))雜菌含量高(LM含量與雜菌含量比為1∶10)的情況下,由于平板計數法沒有前增菌和選擇性增菌步驟,雜菌會嚴重干擾可疑LM菌落的識別和鑒定,不能準確進行LM的計數。在選擇不同的檢測方法時,如不能對食品中LM的數量進行把握,可同時進行兩種定量檢測方法檢測,以期提高樣品中LM檢測的準確性。食品中LM數量隨冷藏和冷凍保存時間的增加而增多,且保存3、5、7 d的同種食品中菌數對比差異顯著(p<0.05),因此冷藏或冷凍于冰箱的食品應縮短存儲時間而盡快食用,減少“冰箱病”的發生率。

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