微生物發酵對牛肉調味基料的增香作用

樊曉盼,馬儷珍,2,*,張伯男,仇泓博

(1.天津農學院食品科學與生物工程學院,天津 300384;2.天津市農副產品深加工技術工程中心,天津 300384)

肉味香精是廣泛用于肉類加工和方便食品中的一類食品調味料,通常是以肉或畜禽骨為原料經熱壓浸提、酶解、美拉德反應制備而成[1]。劉丹等[2]通過優化美拉德反應工藝條件制備出肉香味渾厚的兔肉香精并將其微膠囊化,拓寬了國內肉類香精的市場。劉金凱等[3]以氨基酸和還原糖為底物經美拉德反應制得肉味濃郁、香氣柔和的羊肉味調味基料。呂玉等[4]模擬反應體系制備出有明顯牛肉特征味的牛肉香精。然而采用酶解-美拉德反應制備生產的肉味香精往往香氣不足,外觀不均,通常需添加化學合成類香精和其它食品添加劑等進行調配,以滿足天然肉味香料的濃厚香味,但添加化學合成類香精往往會失去這類產品天然、安全的特點[5]。由于微生物在代謝過程中能夠分泌蛋白酶、脂肪酶等,可作用于大分子物質降解形成小分子產物,可為美拉德反應提供前體物質,還能夠產生特殊的發酵香味,降解或消解某些異味物質,因此學者們認為將發酵技術引入傳統肉味香精的制備工藝,可能會提高肉味香料的風味和安全性[6-8]。

分析食品風味通常采用的是感官評定法,人有著敏銳的嗅覺,感官評定結果更能代表市場實際需求情況,但由于不同的評定人員對氣味和滋味有著不同的敏感程度,而且很容易對風味感知產生疲勞,因此會導致評定結果主觀性較強[9]。電子鼻能夠模擬人體嗅覺器官,將待測樣品揮發出來的氣體通過傳感器檢測得到信號圖譜,從而實現氣味相關化合物和揮發性化合物的快速鑒別[10]。目前電子鼻在食品領域主要用于區分原料的新鮮程度[11]、檢測食品的氣味變化[12-13]、預測產品的貨架期[14]以及快速檢測肉品摻雜摻假[15-16]等。電子舌是在仿生學基礎上發展起來的一種分析、識別液體滋味成分的檢測儀器,實現了對待測液體整體滋味品質進行客觀分析,判別出樣品之間整體味覺上的差異,具有快速、準確、客觀、重復性好等特點[17-18],已經廣泛應用于環境監測[19]、醫藥[20]、食品等領域。

本實驗以冷凍牛胴體用電鋸分割時所產生的牛骨肉末為原料,經熱壓浸提、酶解后接種不同菌種發酵一定時間后,添加氨基酸(半胱氨酸、甘氨酸和丙氨酸)、糖(木糖和葡萄糖)以及維生素VB1進行美拉德熱反應得到牛肉調味基料,采用感官評價結合電子鼻和電子舌對其揮發性氣味和滋味成分進行分析,目的是探討微生物發酵技術應用于牛肉調味基料生產中的可行性,進而為實際生產中發酵劑菌種的篩選以及微生物產香機制的探索提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛骨肉末 冷凍牛胴體電鋸分割時留下的肉末(骨肉比為3∶7),由天津掛月食品有限公司提供;風味蛋白酶(500 L APU/g)、復合蛋白酶(1.5AU/g) 丹麥諾維信公司;薩科WBL-45(肉葡萄球菌+木糖葡萄球菌+清酒乳桿菌)、薩科WBX-43(肉葡萄球菌+木糖葡萄球菌)、薩科BOM-13(清酒乳桿菌)和薩科THM-17(木糖葡萄球菌+戊糖片球菌) 意大利薩科公司;優級氯化鈉 國產分析純,天津市盛淼科技有限公司;L-半胱氨酸、丙氨酸 冀州市華陽華工有限責任公司;甘氨酸 冀州華恒生物科技有限公司;VB1江西天新藥業有限公司;葡萄糖、木糖 山東西王糖業有限公司。

Astree電子舌 法國AlphaM.O.S公司;PEN3電子鼻 德國AIRSENSE公司;SX-500高壓蒸汽滅菌鍋 日本TOMY有限公司;THZ-98AB型恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司;Friocell 22恒溫恒濕培養箱 艾力特國際貿易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備工藝

1.2.1.1 熱壓浸提 稱取牛骨肉末,按照骨肉末和水質量比為1∶4添加蒸餾水,用玻璃棒攪拌后,將其放置于高壓蒸汽滅菌鍋中,根據前期實驗結果在壓力0.1 MPa、浸提溫度133 ℃、浸提時間4 h對牛骨肉末中的蛋白質進行提取[21]。得到牛骨肉蛋白浸提液,冷卻至50 ℃備用。

1.2.1.2 酶解 取上述浸提液,根據本實驗室前期實驗結果[22],采用雙酶同步水解方式(0.06%的風味蛋白酶和0.03%的復合蛋白酶同時加入),酶解溫度45 ℃,自然pH條件下酶解4.5 h,沸水浴滅酶20 min后立即冷卻至30 ℃備用。

1.2.1.3 發酵 首先活化實驗中所用到的薩科WBL-45、WBX-43、BOM-13和THM-17各菌株:分別稱取菌株1 g,溶解在包含49 g牛奶、0.75 g葡萄糖組成的乳液中,混合均勻后常溫放置2 h活化備用。在1.2.1.2的酶解液中分別接種各菌株,接種量均為0.02%,在30 ℃,130 r/min條件下振搖發酵12 h,作為4個實驗組(分別為WBL-45、WBX-43、BOM-13和THM-17組),不接種菌株的作為對照(CK)組。

1.2.1.4 美拉德反應 參考李桂星[23]方法并稍作修改。發酵結束后,以1.3.1.3的發酵液的質量為基準,添加木糖1.2%、葡萄糖1.2%、半胱氨酸0.9%、甘氨酸0.45%、丙氨酸0.45%、VB11.8%后攪拌均勻,110 ℃條件下進行美拉德反應60 min,冷卻、過濾后分別用電子鼻和電子舌分析牛肉調味基料的氣味和滋味并對其進行感官評價。

1.2.2 感官評價方法 本實驗感官評定小組由10名經過培訓的食品專業成員組成(5男5女,年齡在23～45歲之間)[24]。感官評定之前,所有評定成員需在感官評定室待1 h以適應環境。感官評定時,將樣品稀釋10倍進行評定,所有評定人員不可以相互交流。具體評分標準見表1。

表1 牛肉調味基料香氣評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of beef flavoring

1.2.3 電子鼻測定方法 直接頂空吸氣法:取10 g樣品,密封置于室溫一段時間后依次進行測試。每個樣品重復測定3次。電子鼻測試條件:采樣時間為1 s/組,傳感器自動清洗時間為60 s,傳感器歸零時間為10 s,樣品準備時間為5 s,進樣流量為5 mL/s,分析采樣時間為100 s。

測定用電子鼻配有的10個高靈敏度金屬傳感器,具有不同的性能,能夠代表不同類型的揮發性化合物[25](表2)。圖1為電子鼻10個傳感器對5組牛肉調味基料的響應值變化情況。

表2 電子鼻傳感器性能描述Table 2 Composition of sensors in electronic nose and their performances

1.2.4 電子舌測定方法 將待測樣品置于電子舌專用燒杯(25 mL)中待測。每個樣品平行測定6次。

采用第5套傳感器系統,包括SRS、SWS、BRS、STS、UMS、SPS、GPS共7根傳感器,選擇Ag/AgCl作為參比電極。其中前5種(SRS、SWS、BRS、STS、UMS)分別為對酸味、甜味、苦味、咸味和鮮味敏感的傳感器,能夠反映不同樣品五種滋味的相對強度大小。傳感器經活化、校正后測樣。

1.3 數據統計分析

實驗重復進行3次。數據采用Microsoft Excel 2003計算各個指標的平均值和標準差,Statistix 8.1軟件包中Linear Models程序進行,差異顯著性(p<0.05)分析使用 Tukey HSD程序。采用SigmaPlot 10.0進行繪圖。采用電子鼻和電子舌自帶軟件Alpha soft對檢測結果進行主成分分析(PCA)。

2 結果與分析

2.1 感官評定結果

表3反映了不同菌種發酵的牛肉調味基料的香氣感官評定結果。與未發酵的CK組相比,經微生物發酵后制成的牛肉調味基料香氣得分會顯著提高,不僅會產生特有的發酵香味,還能一定程度上增加產物的特征香氣,賦予其飽滿的肉香味和持久的回味感。不同菌種對牛肉調味基料的香氣貢獻作用不同,從表3可看出,WBL-45和WBX-43的賦香效果相似,而BOM-13組除了具有發酵香氣外,其他特征均與CK組相近,這表明清酒乳桿菌的代謝產物對酶解液的影響較小,接種清酒乳桿菌不會顯著增強調味基料的香氣。經THM-17發酵制成的調味基料香氣評分顯著高于其他4組,呈現特有的發酵香氣,且牛肉特征香氣濃郁,肉香味飽滿,這說明戊糖片球菌發酵能夠釋放更豐富的氨基酸、肽等風味前體物質,為美拉德反應提供充分的前體反應物,從而增強調味基料的香氣。

表3 不同菌種發酵的牛肉調味基料感官評定結果分析Table 3 Sensory evaluation result analysis of beef paste flavoring fermented by different strains

2.2 不同菌種發酵的牛肉調味基料的電子鼻檢測結果

2.2.1 響應值分析 從圖1中可以看出,W1W傳感器對5組牛肉調味基料的響應值均為最大,接下來依次是W2W、W5S和W1S傳感器,其余傳感器的響應值變化差異不顯著(p>0.05),因此圖中僅對影響較大的4個傳感器響應值進行顯著性分析,說明本實驗制備的5組牛肉調味基料的主要揮發性成分為硫化物。由于每個傳感器會對某一類特征氣體響應強烈,能夠用來反應樣品中揮發性物質貢獻率的大小,從而可以確定待測樣品中的特征揮發性成分。響應值越高,表明此傳感器對于該樣品中揮發性物質的分析所起作用越大,反之,則說明該傳感器所起作用較小。

圖1 電子鼻10個傳感器對5組牛肉調味基料的響應值變化圖Fig.1 Effect of E-Nose 10 sensors on the response value of Beef paste flavoring注:圖中小寫字母表示不同傳感器對同一樣品的差異顯著性,大寫字母表示同一傳感器對不同樣品的差異顯著性,相同字母表示差異不顯著(p>0.05),不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

實驗發現,THM-17組的硫化物和芳香成分響應值顯著高于其他4組(p<0.05),說明木糖葡萄球菌和戊糖片球菌協同作用對風味物質形成貢獻最大。資料報道,戊糖片球菌具有較強的競爭性和環境適應性,可分泌蛋白酶、脂肪酶和過氧化氫酶,進而將蛋白質分解為小分子物質(肽和氨基酸),將脂肪分解為短鏈脂肪酸和脂類物質,促進良好風味生成[26]。此外,戊糖片球菌能夠充分利用碳水化合物從而降低發酵體系的pH,不僅賦予其特有的風味,還能抑制病原菌和腐敗菌的生長,提高產品的安全性[27]。木糖葡萄球菌能夠促進蛋白降解,顯著增加鮮味氨基酸的總量和比例[28]。兩種菌復配后能夠協同作用,使產品產生優良風味。

對于響應值最大的W1W傳感器,WBX-43和BOM-13之間差異不顯著(p>0.05),但它們均顯著高于WBL-45和CK組(p<0.05),而WBL-45和CK組之間差異不顯著(p>0.05)。說明經過微生物發酵過程,能夠在一定程度上明顯提高牛肉調味基料的風味。但菌種的種類和配比對風味形成影響很大,本實驗說明采用THM-17菌株發酵,可以對牛肉調味基料的風味起到一定的增強作用。

2.2.2 主成分分析 主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)是在對樣品特性一無所知的前提下,通過降維處理對原始數據向量進行線性變換,得出最主要和貢獻率最大的因子,從而尋找樣品間差異的一種處理方法。PCA圖可用來反映電子鼻能否將不同菌種發酵的牛肉調味基料區分開來。

由圖2 可以看出,在Correlation相關性矩陣模式下,第一主成分貢獻率為97.01%,第二主成分貢獻率為2.44%,總貢獻率達到99.45%,大于90%,表明這兩個主成分能夠用來反映樣品的實際情況。每組橢圓代表著不同菌種發酵后的牛肉調味基料揮發性氣味的數據分布,可以看出5組樣品的電子鼻檢測信號的特征區域完全沒有重疊,說明電子鼻可以將不同菌種發酵的牛肉調味基料很好的區分開。PCA圖中第1主成分的方差貢獻率遠大于第2主成分的方差貢獻率,說明不同樣品在橫坐標上的距離越遠,樣品間差異越大;不同樣品在縱坐標上的距離差異則不會顯著影響樣品間差異。從圖2可以看出,經過發酵處理的4組與對照組在橫坐標之間的距離遠近依次為THM-17>WBX-43>BOM-13>WBL-45,這一結果與感官評價結果一致,均說明經過THM-17菌株發酵對牛肉調味基料的影響最大。

圖2 不同菌種發酵的牛肉調味基料的PCA主成分分析Fig.2 Principal component analysis of beef paste flavoring fermented by different strains

2.3 不同菌種發酵的牛肉調味基料的電子舌檢測結果分析

2.3.1 樣品雷達指紋圖譜 5組牛肉調味基料的滋味雷達指紋圖譜見圖3,滋味雷達圖更能直觀地反映樣品在不同傳感器的響應值有差別,圖中的數值即反映不同傳感器對樣品的響應值,SRS、SWS、BRS、STS、UMS分別代表5根傳感器,即酸味、甜味、苦味、咸味和鮮味。由圖3可以看出,除CK組以外,電子舌5根傳感器對其他4組牛肉調味基料的信號響應圖譜較相似。總體來看,UMS(鮮味)和STS(咸味)所代表的傳感器響應值較高。說明微生物發酵能夠形成鮮味物質,經發酵的4組牛肉調味基料的鮮味響應值均為7,顯著高于CK組的鮮味響應值2。SRS傳感器代表的是對酸味較為敏感,從雷達圖可看出,5組牛肉調味基料的酸味大小依次為CK>THM-17>WBL-45>WBX-43>BOM-13,且經過發酵處理的4組酸味值較接近,均低于CK組。從BRS(苦味)傳感器響應值可看出,未經發酵處理的CK組苦味值遠遠高于其他4組(p<0.05),這是因為微生物代謝酶系能夠進一步分解苦味肽[29],從而降低苦味值,說明采用發酵工藝能夠明顯改善產品的口感。

圖3 不同菌種發酵的牛肉調味基料雷達指紋圖譜Fig.3 Radar fingerprints of beef paste flavoring fermented by different strains

2.3.2 主成分分析 實驗采用電子舌自帶軟件Alphasoft V14.2對檢測到的5組牛肉調味基料的信號值進行主成分分析,以第1主成分為橫坐標,第2主成分為縱坐標繪制二維圖,如圖4所示。從圖4可以看出,第1主成分(PC1)與第2主成分(PC2)的貢獻率分別為96.585%和3.078%,二者之和達到99.663%,說明主要成分能夠很好地反映樣品的實際情況,電子舌能夠將5組牛肉調味基料很好地區分開來,由此證明5組牛肉調味基料在滋味上存在明顯差別。主成分分析圖中,樣品間的相對距離越小,樣品滋味越接近。即樣品BOM-13與WBX-43在滋味上區別較小,樣品THM-17與CK組的區別較大,說明清酒乳桿菌對牛肉調味基料的風味貢獻作用較小,而戊糖片球菌對其則有較強的賦香作用。

圖4 不同菌種發酵的牛肉調味基料的PCA主成分分析Fig.4 Principal component analysis of beef paste flavoring fermented by different strains

電子舌鑒定結果表明本實驗所選用的菌株對牛肉調味基料均具有增鮮作用,而不同菌種由于產酸能力和代謝成分不同賦予產品的呈味效果也不一樣,今后需結合菌株的代謝途徑進一步分析其與風味物質形成的關系。

3 討論

生肉只有通過煎、炸、燉、煮、烤等加熱手段后才能產生誘人的香味,這些香味物質主要是由肉本身所含有的微量香味前體物質在熱加工過程中發生的一系列復雜化學變化形成的[30]。肉中的肉香味前體物質主要有兩類:一類是氨基酸、核苷酸、肽、硫胺素以及還原糖,它們可通過熱反應產生基本肉香味物質,主要是含硫化合物,這與本實驗電子鼻檢測結果一致(見2.2.1);另一類是甘油三酯、磷脂和脂肪酸,通過熱降解產生特征肉香味。氨基酸、肽等小分子物質是由蛋白質水解形成,通常采用酸堿法、酶法和微生物發酵法制得[31]。酸堿法水解徹底,氨氮含量高,成本較低,但其屬于化學水解,容易產生微量有害物質氯丙醇[32]。酶法水解的蛋白味道柔和純凈,可作為美拉德反應生產肉味香料的良好底物,然而使用此類蛋白水解物生產的肉味香料帶有苦味,這是因為隨著酶解程度的加深,越來越多的疏水性氨基酸暴露出來,進而導致苦味增加[33]。微生物在代謝過程中會分泌一些酶類,可將骨類蛋白質或多肽適度水解,不形成苦味肽,甚至能脫除苦味,并提高氨基態氮的含量,增強產品風味。Michiko M等人利用E,iinaAannas細菌與胃蛋白酶水解的酪蛋白水解液作用,發現微生物具有直接脫苦效果。劉通訊[25]從雞肉酶解液中提取苦味肽,分別接種乳酸菌和釀酒酵母,通過對游離氨基酸釋放情況的檢測并對苦味進行評分,揭示了酶解液中苦味的本質,結果表明乳酸菌和酵母有肽酶體系,它們有能力將苦味肽進一步水解,使苦味肽的苦味減弱甚至完全消失。解銘[34]對鱈魚脫苦方法進行研究,經過研究脫苦的多肽含量、疏水性指數以及蛋白酶和氨肽酶酶活,結果發現酵母酶系有脫苦作用。

本實驗未經發酵的CK組苦味分值遠遠高于其他4組(見2.3.1),說明酶解過程使得疏水性氨基酸暴露出來,形成苦味肽,接觸味蕾產生苦味。通過接種微生物發酵,能夠顯著降低苦味值,且發現清酒乳桿菌和戊糖片球菌的脫苦效果高于木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌。但具體脫苦機制尚不清楚,需要對微生物代謝過程中的產酶體系進行研究,進一步解釋其脫苦作用機理。

從特有發酵香味角度分析,發酵肉制品中常用的微生物有霉菌、酵母菌和細菌。本文選用乳酸菌(清酒乳桿菌和戊糖片球菌)和葡萄球菌(木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌)。乳酸菌能夠產生乳酸和細菌素,不僅促進良好風味的產生,還能降低體系的pH,抑制腐敗微生物的生長和細菌毒素的形成,提高產品安全性[35]。徐瑋東等[36]發現接種清酒乳桿菌可加速發酵香腸的成熟過程,并且能夠降解肌肉蛋白,生成游離氨基酸進而促進風味的形成。葡萄球菌含有蛋白酶和脂肪酶,能夠降解蛋白質和脂肪,對芳香氣味的形成具有優勢作用。Stahnke L H[37]比較了不接菌和接種一株木糖葡萄球菌的香腸的風味,結果發現接種木糖葡萄球菌的香腸具有一種水果味。結果還表明薩拉米的特征風味跟乙酯類和烷烴類物質有關,而接種木糖葡萄球菌的發酵香腸可以產生這類揮發性成分。Berdagtle等研究結果指出葡萄球菌和微球菌能夠促進干香腸芳香氣味的形成。

通過感官評定結合電子鼻和電子舌檢測結果表明，經微生物發酵處理的牛肉調味基料均與未發酵的對照組具有明顯差異,且不同菌種發酵的牛肉調味基料氣味和滋味之間區別較為明顯。為便于探討微生物發酵工藝對天然牛肉調味基料風味增強的機理,需要對發酵液中游離氨基酸、游離脂肪酸進行測定,并對其美拉德反應后的調味基料中滋味成分(核苷酸關聯化合物)進行測定,再結合GC-MS對其揮發性化合物得分析結果,建立風味與蛋白、脂肪降解之間的關系,進而探討微生物發酵工藝對天然牛肉調味基料風味的增強效果。

4 結論

實驗發現,在傳統調味基料加工工藝基礎上,增加微生物發酵工藝,對牛肉調味基料可起到明顯的賦香效果,但接種不同菌種會影響牛肉調味基料的風味形成。感官評定結合電子鼻和電子舌檢測結果表明,與本實驗所用的其他菌種相比,接種THM-17(木糖葡萄球菌+戊糖片球菌)的牛肉調味基料在氣味和滋味上與未發酵的CK組之間差異最大(p<0.05),接種THM-17菌種將酶解液進一步發酵再進行美拉德反應,可以得到風味最佳的天然牛肉調味基料,說明選擇適宜的發酵菌株增加發酵環節,可以對調味基料起到明顯的賦香效果,研究結果可為實際生產提供數據支持。

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