山西省旱柳古樹資源遺傳多樣性的SSR分析

張 亮，王振龍，高志文，馬 晶，樊明瑞，韓志校

(1.山西省太原市林業科學研究所，山西 太原 030009；2.河北農業大學，河北 保定 071000 )

旱柳(SalixmatsudanaKoidz.)，屬于楊柳科柳屬落葉大喬木，其分布廣泛，在全國各地都有栽培，主要品種與變種有饅頭柳、絳柳、龍須柳等。它是防護林、水土保持林、園林綠化林及用材林的重要組成樹種，具有較高的生態價值和經濟價值。古樹是有生命的活化石，是大自然給人類的寶貴財富，具有重要的科研、歷史、文化價值，保護好它們有著十分重要的意義。

SSR已成為在生物上應用最廣、最為重要的分子標記。目前，SSR標記已經在眾多植物種類中得到證實和應用,例如,葡萄、松樹等物種。而柳樹分子標記的研究始于20世紀90年代，如，王輝等利用SSR標記的方法對楊柳樹遺傳多樣性進行了分析，劉恩英建立和優化了柳樹SSR反應體系，王源秀利用杞柳和簸箕柳候選雜交親本對其SSR指紋進行了分析等。而對山西省不同地區旱柳古樹資源遺傳多樣性的SSR研究還未見報道。筆者嘗試用SSR分子標記的方法對采自山西省7個地區的49份旱柳古樹材料進行遺傳多樣性檢測，旨在從DNA分子水平闡明其地區間的遺傳差異，為旱柳古樹資源的有效保護，柳樹新品種的選育及遺傳改良抗性研究提供理論支持，并從分子水平上豐富對古樹的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

2009年至2011年，太原市林業科學研究所柳樹課題組收集了山西省境內的古旱柳品種(見圖1)。通過嫁接復壯、扦插等繁殖手段，至2012年已培育出49個合格的古旱柳品種2年生苗木各200株。于當年秋季苗木生長停止后，在樹冠1/3處，采集枝條、葉片等材料，封裝進冷藏保溫箱并做好標記，在4 h內送至河北農業大學進行試驗。

圖1 供試材料所在地理位置及取樣情況

1.2 方法

基因組DNA提取采用改良的CTAB法。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，經紫外分光光度計測定純度后，再用ddH2O稀釋至20 ng/μL左右。

試劑：所用引物均來自文獻[12-13]，并由上海生工生物工程技術服務有限公司和北京天一輝遠生物科技有限公司合成。2×Taq MasterMix購自北京康為世紀生物科技有限公司。

PCR反應體系：柳樹DNA基因組SSR-PCR 10 μL 反應中最優條件為2×Taq MasterMix 5μL，引物濃度為1.0 μmol/L,H2O為3μL,DNA為1μL.

PCR擴增反應：PCR擴增94 ℃預變性5 min后，95 ℃變性50 s，52 ℃復性50 s，72 ℃延伸1 min，35個循環。最后一個循環結束后，再72 ℃延伸7 min，得擴增產物。

反應產物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳40 min左右，取出進行AgNO3染色。再用顯色液(1.5%NaOH，0.4%甲醛)顯色，直至條帶清晰為止，照相并記錄。

1.3 數據統計分析

選擇擴增條帶清晰且有多態性的SSR標記進行數據統計，假定膠上遷移率相同的條帶均來自同一位點上的同一等位基因。對每個樣品的擴增電泳譜帶進行統計，有帶記為1，無帶或模糊的記為0，形成0/1數據矩陣輸入Excel中。SSR數據用POPGENE32和DPS軟件進行遺傳多樣性數據計算。

2 結果與分析

2.1 古旱柳引物篩選與多態性分析

從25對引物中選取10對擴增條帶清晰、重復性好、特異性高的引物。這10對引物在7個地區的49個旱柳古樹品種中共擴增出條帶33條，其中多態性條帶26條，占78.79%(如表1).每對引物擴增位點數為2～5，平均每對引物擴增3.3個位點。

表1 引物多態性分析

從擴增結果來看，SSR引物得到的擴增產物片斷大小主要分布在80 bp～320 bp之間。其中引物SB24，SB233，GslMCT011，ORNL140多態性最高，達到100%；ORPM-028多態性最低，為50%；其余引物介于兩者之間。

圖2為引物SB24和引物ORPM-028擴增出的部分樣品圖譜。

圖2 SB24引物和ORPM-028引物對供試的部分旱柳古樹的SSR擴增譜帶

從圖2可以看出，不同引物在相同材料中產生的譜帶信息不同，同一引物在不同的材料中產生的譜帶信息也不相同。這說明供試的旱柳古樹在DNA+水平上具有一定的差異。

2.2 古旱柳種群內遺傳多樣性參數

地區間旱柳古樹的多態位點百分率、Nei′s基因多樣性和有效等位基因范圍分別為39.39%～69.70%，0.121 6～0.208 6和1.189 3～1.341 2,見表2.

表2 7個地區間旱柳古樹資源的遺傳多樣性參數值

從表2中可以看出,7個地區間多態性比率差異較大，在39.39%～69.70%之間。其中朔州(地區B)地區的多態性比率最高，達到了69.70%；晉中(地區E)、臨汾(地區G)、呂梁(地區F)最低，為39.39%.7個地區的多態性高低為：B>A>C>D>E，G，F.各群體間Nei′s基因多樣性和有效等位基因排列與多態位點百分率一致。

2.3 古旱柳群體間遺傳一致度及遺傳距離

古旱柳群體的遺傳一致度(I)與遺傳距離(D)見表3.

表3 旱柳古樹群體的遺傳一致度與遺傳距離

由POPGENE32軟件計算的7個地區間旱柳古樹的遺傳距離和遺傳一致度表明，古旱柳群體間的遺傳一致度很高(0.865 1～0.990 7)，尤其是地區C與地區D之間遺傳相似度最大(0.990 7)，接近于1，表明兩個地區幾乎沒有分化。地區E與地區G之間的遺傳一致度最低(0.865 1)。遺傳距離在地區E和地區G之間最大(D=0.144 9)，地區C和地區D之間最小(D=0.009 4)。

不同地區旱柳古樹的遺傳聚類圖見圖3.

圖3 不同地區旱柳古樹的遺傳聚類圖

由圖3可以看出，7個地區的旱柳古樹資源通過聚類分成了兩大類，第Ⅰ類為：大同(地區A)、朔州(地區B)、忻州(地區C)、太原(地區D)、晉中(地區E)、呂梁(地區F)；第Ⅱ類為：臨汾(地區G)。這也說明了處在山西省中北部6個地區的旱柳古樹聚在了一起，而處在南部臨汾地區的單獨聚在了一起。

2.4 不同地區古旱柳材料的聚類分析

利用DPS軟件中的UPGMA法對分布在山西省7個地區的49份旱柳古樹材料進行聚類分析，結果見圖4.

圖4 不同地區旱柳古樹植株的遺傳聚類分析

由圖4可以看出，在遺傳距離為0.53處，所有植株可以分為兩類：一類是包括所有地區的40個古旱柳品種；一類是包括大同、朔州、忻州3個地區的9個古旱柳品種。說明這9個品種與上述40個古旱柳品種有一定的差異性，同時，49個古旱柳品種個體的聚類結果與7個地區間的聚類有差別。

3 討論與結論

研究表明，一個物種遺傳多樣性越高，對環境變化的適應能力就越強，越容易擴展其分布范圍和開拓新環境。筆者用10對引物對采自山西省7個地區的49個旱柳古樹植株進行了地區間遺傳多樣性分析，結果表明，其具有豐富的遺傳多樣性。選用的10對引物共擴增出條帶33條，其中多態性條帶有26條，占78.79%.由此可見，這7個地區的旱柳古樹材料具有比較豐富的SSR多態性。

Nei′s遺傳多樣性揭示了各地區間遺傳多樣性水平，利用SSR分子標記方法測得的7個地區旱柳古樹的Nei′s遺傳多樣性范圍為0.121 6～0.208 6，均值為0.165 3，其排列順序依次是：朔州>大同>忻州>太原>晉中、臨汾、呂梁,它與地區間的多態性比率一致。說明這7個地區間旱柳古樹具有較豐富的遺傳多樣性。

通過對這7個地區的旱柳古樹進行聚類分析可知，地區間的遺傳一致度很高，尤其是地區C與地區D之間遺傳相似度最大，接近于1，表明兩地區幾乎沒有分化；地區E與地區G之間的遺傳一致度最低。7個地區間聚類結果得到兩類，并且具有地理相關性，一類是種植在山西省中北部6個地區的旱柳古樹，一類是種植在山西省南部臨汾地區的旱柳古樹。

對來自這7個地區的49個品種個體之間的聚類結果表明，雖然柳樹主要是通過無性繁殖，但是來自山西省7個不同地區的49個旱柳古樹品種間卻存在遺傳差異，并非起源于同一無性系。另外，49個旱柳古樹材料聚類結果呈現混雜性，并不是同一種植地區的植株聚在一起。說明這些古旱柳個體是在幾十年至幾百年前栽種的，由于時間不同，應用的品種可能不同。雖然是在同一地區甚至同一地點收集的旱柳古樹，其遺傳差異也可能會很大。從而也進一步說明了這些旱柳古樹具有廣泛的遺傳多樣性。

山西省旱柳古樹存在廣泛的遺傳多樣性，是寶貴的遺傳資源，應加大保護和研究力度，為柳樹的遺傳改良提供育種材料。

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