近紅外光譜快速測定健胃消食片薄膜包衣衣膜厚度研究*

★ 吳建程 羅曉健 劉旭海 汪健 樂渝寧 林劍鳴 楊洋 何雁***（1.井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院 江西 吉安 000；2.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心 南昌 0006；.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 000；.江中制藥（集團(tuán)）有限責(zé)任公司 南昌 0096）

片劑的薄膜包衣可以提高片劑防潮、防吸濕性能；增加產(chǎn)品的美觀度，同時有利于流通運(yùn)輸?shù)龋?-2］。薄膜包衣終點(diǎn)判斷是工業(yè)生產(chǎn)上質(zhì)量控制關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一［3］，生產(chǎn)上常根據(jù)包衣時間、包衣液用量、包衣增重等［4］指標(biāo)判斷薄膜包衣終點(diǎn)，常用判斷方法易受包衣液噴霧干燥、片芯磨損破裂、水分蒸發(fā)、工人操作經(jīng)驗等因素影響，難以準(zhǔn)確判定包衣終點(diǎn)，容易導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量批間差異大、薄膜包衣質(zhì)量不穩(wěn)定。近紅外光譜分析技術(shù)是近年來用于制藥行業(yè)的過程分析技術(shù)，樣品制備簡單，可直接對固體藥品進(jìn)行快速、無損檢測。該技術(shù)已用于緩控釋制劑［5］、糖包衣片［6］，滴丸［4］、腸溶片［7］及在線監(jiān)測［8］等包衣終點(diǎn)判斷領(lǐng)域的研究，但在中藥片劑薄膜包衣厚度方面的研究尚未報道。本實驗以健胃消食片為研究對象，利用近紅外光譜分析技術(shù)建立健胃消食片衣膜厚度快速、無損的測定方法，為健胃消食片包衣終點(diǎn)在線檢測技術(shù)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料 歐巴代胃溶型黃色薄膜包衣粉（美國卡樂康（中國區(qū)·上海）公司）；片芯及不同包衣時間段的包衣片（江中制藥有限責(zé)任公司提供）；切片石蠟（熔點(diǎn)范圍：57-61℃；上海標(biāo)本模型廠）。薄膜包衣預(yù)混劑（歐巴代III，上海卡樂康包衣技術(shù)有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 Bruker MPA型傅立葉變換近紅外光譜儀（德國布魯克光學(xué)儀器公司），配有積分球漫反射檢測器，附PBS檢測器，OPUS光譜采集和處理軟件；Unscrambler v9.2軟件；LEICA RM2016石蠟切片機(jī)（德國徠卡儀器有限公司）；Olympus體視顯微鏡（SZ61）［日本奧林巴斯株式會社］；Canon Powder Shot G12數(shù)碼相機(jī)（日本佳能公司）；Image-Pro Plus圖像分析軟件；測微尺：Openlink TS-M1。高效薄膜包衣機(jī)（意大利伊馬集團(tuán)（IMA S.p.A.）型號：HT/F—700）。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同包衣時間樣品收集 健胃消食片為類三角形，片芯直徑9mm，片重約為0.8g。采用高效薄膜包衣機(jī)包衣，分別在包衣進(jìn)行60、70、80、90、100、110、120min（按生產(chǎn)工藝要求包衣120min為“成品片”）收集樣品，每次200片，共取8批次，用于采集近紅外漫反射光譜。

2.2 薄膜包衣片近紅外圖譜采集 在樣品掃描前，近紅外光譜儀開機(jī)預(yù)熱30min并進(jìn)行峰位校正。測試通過后以空氣為參比扣除背景，采用積分球漫反射方式開始采集近紅外光譜。每個待測樣品正反面重復(fù)掃描3次，取其平均值。每組測試20片。

采集條件：掃描波長頻率范圍為12000～4000cm-1，掃描步長4cm-1，掃描次數(shù)32次，分辨率8cm-1，環(huán)境溫度23±1℃，相對濕度42±2%。采集得到原始光譜經(jīng)OPUS光譜分析軟件處理后得相應(yīng)的樣品平均光譜，如圖1所示。結(jié)果顯示：包衣60min至包衣成品片，其近紅外原始平均光譜變化平穩(wěn)有序，重疊性高，存在較多的冗余信息，為提取光譜中有效信息，光譜須做進(jìn)一步預(yù)處理。

圖1 健胃消食片近紅外原始平均圖譜

圖2 利用光學(xué)顯微鏡測量衣膜厚度

表1 不同包衣時間樣品衣膜厚度分布情況（） μm

表1 不同包衣時間樣品衣膜厚度分布情況（） μm

時間 14110013 14110078 14120006 14120031 15010002 15020068 15030102 15040094 60min. 5.32±1.17 5.46±1.05 6.04±1.43 4.87±1.39 5.18±1.26 5.28±1.09 3.52±1.27 5.43±1.04 70min. 7.28±0.89 7.23±0.67 6.94±1.01 7.07±0.95 7.13±1.14 7.26±0.75 6.79±0.96 7.37±0.77 80min. 9.22±0.67 8.95±0.51 8.66±0.49 9.04±0.62 8.87±0.68 9.24±0.53 9.12±0.56 9.28±0.63 90min. 10.66±0.54 10.87±0.49 11.14±0.37 11.26±0.32 9.57±0.46 10.95±0.33 11.35±0.37 10.97±0.52 100min. 12.46±0.50 12.33±0.63 13.02±0.37 12.39±0.63 12.89±0.52 13.11±0.29 11.85±0.62 12.77±0.39 110min. 14.57±0.27 14.09±0.15 14.88±0.19 15.33±0.20 13.52±0.12 14.29±0.08 14.83±0.15 14.08±0.23 120min. 16.78±0.09 16.53±0.11 17.12±0.08 16.51±0.14 15.52±0.07 16.65±0.06 15.99±0.18 17.05±0.06

由表1可知，8批片芯隨著包衣時間增加，衣膜厚度逐漸增大。對表1數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，如表2所示。表2結(jié)果表明8批樣品不同包衣時間的衣膜厚度無顯著性差異（P＞0.05），說明包衣過程不同批次間樣品衣膜厚度的差異小，包衣質(zhì)量穩(wěn)定。

表2 樣品衣膜厚度方差分析

2.4 薄膜包衣片衣膜厚度NIRS定量模型的建立

2.4.1 校正集與驗證集樣本的選擇 在所采集的8批次7個不同包衣時間段包衣片（共1120個樣品）的近紅外平均光譜中，隨機(jī)選取其中的2/3作為校正集樣品，其余1/3作為驗證集樣品。

2.4.2 光譜區(qū)間及預(yù)處理方法的選擇 樣品近紅外光譜常出現(xiàn)許多高頻隨機(jī)噪音、基線漂移等干擾［9］，同時由于樣品不均勻和光散射等因素導(dǎo)致的干擾信息也會被帶入光譜中［10］。因此，在光譜正式分析之前需對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理以濾除噪音。

本實驗運(yùn)用OPUS自帶的定量分析軟件進(jìn)行自動優(yōu)化，將各種光譜預(yù)處理方法排列組合后再利用PLSR建模。利用決定系數(shù)（R2）和內(nèi)部交叉驗證均方根誤差（Root Mean Square Error of Cross Validation，RMSECV）作為定量模型的評價參數(shù)［11］，以考察不同波長范圍和預(yù)處理方法對模型評價參數(shù)的影響。樣品光譜選擇范圍和預(yù)處理方法經(jīng)OPUS軟件處理，結(jié)果見表3。表3可知，在波數(shù)位于6101.9～4246.7cm-1內(nèi)，以一階導(dǎo)數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（Standard Normal Variable transformation，SNV）（17平滑點(diǎn)）為預(yù)處理方法時，所建模型最佳，決定系數(shù)R2=0.9330及RMSECV=1.34均達(dá)到最優(yōu)組合。

表3 不同光譜范圍和預(yù)處理方法的模型參數(shù)結(jié)果

圖3 最優(yōu)預(yù)處理方法樣品近紅外光譜

樣品原始近紅外平均光譜經(jīng)最佳光譜預(yù)處理后，OPUS軟件顯示其圖譜如圖3所示。圖3結(jié)果表明，與樣品近紅外原始平均吸收光譜相比，經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)+SNV（17平滑點(diǎn)）預(yù)處理后的本樣品在目標(biāo)波段（6101.9～4246.7cm-1）內(nèi)出現(xiàn)更多的吸收峰且各峰形、峰位、峰強(qiáng)結(jié)構(gòu)清晰，易于辨識。因此，從吸收光譜上也再次驗證上述光譜區(qū)間選擇和預(yù)處理方式為本模型最佳組合方法。

2.4.3 主因子數(shù)的確定 本實驗采用OPUS軟件內(nèi)部交互驗證法來選擇最佳主因子數(shù)，即RMSECV最小值所對應(yīng)的主成分?jǐn)?shù)（Rank）為最佳主因子數(shù)。在6101.9～4246.7cm-1內(nèi)，樣品光譜經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)+SNV（17平滑點(diǎn)）預(yù)處理后，采用交互驗證法確定主因子數(shù)。結(jié)果見表4。

表4 內(nèi)部交叉驗證均方根誤差與主因子的關(guān)系

表4結(jié)果顯示，模型主因子數(shù)為7時，RMSECV為1.34，偏移為0.00143，表明RMSECV和偏移均在合理范圍內(nèi)；相對分析誤差（Residual Predictive Deviation，RPD）為3.72。一般來說，RPD值大于3表明近紅外定量模型較為理想，可以較好地應(yīng)用于實際預(yù)測［12］。因此，本模型采用主因子數(shù)為7時預(yù)測能力最好。故選擇OPUS軟件推薦的主因子數(shù)。

2.5 近紅外光譜定量模型的驗證

集團(tuán)（總局）黨委第一時間制訂下發(fā)了《深入學(xué)習(xí)宣傳貫徹習(xí)近平總書記在墾區(qū)考察時的重要講話精神實施方案》。方案要求，墾區(qū)上下要深刻領(lǐng)會、準(zhǔn)確把握習(xí)近平總書記對北大荒一系列重要講話精神實質(zhì)和深刻內(nèi)涵，把思想和行動統(tǒng)一到習(xí)近平總書記對農(nóng)墾改革發(fā)展的重大判斷和部署要求上來。總局黨委宣傳部下發(fā)了《深入學(xué)習(xí)宣傳習(xí)近平總書記重要講話精神的通知》，召開了學(xué)習(xí)宣傳總書記重要講話精神新聞策劃會議，對新聞媒體營造氛圍、推動學(xué)習(xí)宣傳習(xí)近平總書記重要講話精神工作不斷普及深入做出部署。墾區(qū)各級黨組織通過精心組織、周密策劃，上下齊動，多措并舉，迅速掀起了學(xué)習(xí)宣傳習(xí)近平總書記重要講話的精神熱潮。

2.5.1 模型的內(nèi)外部預(yù)測驗證 原始平均光譜在波數(shù)范圍6101.9～4246.7cm-1內(nèi)，經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)+SNV（17平滑點(diǎn)）預(yù)處理，維數(shù)為7，建立PLSR包衣膜厚度定量模型。利用校正集光譜進(jìn)行內(nèi)部交叉驗證，其NIRS預(yù)測值與真實值之間的相關(guān)性如表5所示。

表5 衣膜厚度內(nèi)部驗證預(yù)測值與真實值線性關(guān)系

表5結(jié)果所示，模型決定系數(shù)R2=0.9330，RMSECV=1.34，RPD=3.72。模型經(jīng)內(nèi)部交叉驗證結(jié)果表明樣品衣膜真實值與預(yù)測值之間存在良好的線性關(guān)系。

運(yùn)用驗證集樣品（樣品總數(shù)的1/3）對上述所建預(yù)測模型進(jìn)行外部驗證，得驗證模型決定系數(shù)R2=93.61，預(yù)測均方根誤差RMSECV=1.28，RPD=4.3。結(jié)果表明所建定量模型相關(guān)性較好。

2.6 NIRS模型方法學(xué)研究

2.5.1 重復(fù)性 取1組樣品，在同一時間內(nèi)利用同一采集條件分別對其重復(fù)掃描10次近紅外光譜，將所得光譜按上述方法建模，計算樣品衣膜厚度，考察方法的重復(fù)性。計算10次結(jié)果的RSD分別為1.80%、1.66%、1.31%、2.24%、1.19%、1.27%、1.83%、2.01%、1.04%（n=10），表明模型重復(fù)性較好。

2.5.2 中間精密度 同一樣品在6天內(nèi)分別由不同操作人員進(jìn)行近紅外光譜掃描，將所得光譜按上述方法建模，計算樣品衣膜厚度。考察不同人員操作時方法的精密度，RSD分別為2.92%、2.45%、1.99%、1.32%、1.38%、1.16%，表明同一樣品經(jīng)不同人員在不同時間內(nèi)測量，本模型中間精密度良好。

2.5.3 重現(xiàn)性 由不同操作人員在不同操作環(huán)境下（環(huán)境1：t=15℃，RH=60%；環(huán)境2：t=25℃，RH=42%）對同組樣品分別測量3次，每天測量一次，共6次測量結(jié)果。以此進(jìn)行方法學(xué)重現(xiàn)性考察。RSD分別為2.56%、2.71%、3.23%、1.93%、2.89%、2.95%，表明樣品經(jīng)不同人員在不同操作環(huán)境下測量，本模型重現(xiàn)性良好。

2.7 樣品實測值與預(yù)測值驗證

取10批健胃消食片，每批各10片進(jìn)行近紅外掃描取平均光譜，用所建校正模型得到預(yù)測厚度。每批測定衣膜的平均真實厚度。結(jié)果見表6。

表6 未知樣品衣膜厚度真實值與預(yù)測值結(jié)果

由表6結(jié)果可知，10批未知樣品衣膜厚度預(yù)測值與真實值相對誤差較小，模型預(yù)測結(jié)果比較可靠。

3 討論

3.1 切片方法與包衣時間的選擇 NIRS法測定衣膜厚度的原理是隨著包衣厚度的不同，對應(yīng)的NIRS有效譜段的吸光度也會不同。其中衣膜厚度真實值可通過光學(xué)顯微鏡-切片法獲得，即用石蠟將樣品包埋，常溫冷卻固化后采用鋒利刀片按樣品豎直方法以每次5μm快切的方法進(jìn)行樣品切片，再利用光學(xué)顯微鏡法獲得8批7個不同時間段的薄膜包衣真實厚度值。實驗結(jié)果表明，片芯隨著包衣時間的增加衣膜厚度逐漸增大，包衣60min前，沒有形成完整的衣膜，而60min后能夠檢測到完整的衣膜，故本實驗只采用了60min后的樣品的近真實衣膜厚度與紅外光譜建立數(shù)學(xué)預(yù)測模型。在包衣120min后（即成品片），實驗樣品衣膜厚度均在15.5～17.0μm，實際生產(chǎn)結(jié)果表明其具有較好的防潮、美觀效果。

3.2 近紅外光譜建模方法分析 近紅外光譜由分子振動的非諧振性使分子振動從基態(tài)向高能級躍遷時產(chǎn)生。其主要吸收峰是C—H，N—H，O—H等含氫基團(tuán)的倍頻及合頻吸收［13］。其波數(shù)范圍為12820～3959cm-1（780～2526nm）。其中 5500～4000cm-1為近紅外譜的合頻譜區(qū)，樣品信息大，是近紅外分析最常用的波段［14］；7500～5500cm-1波段是近紅外譜的一級倍頻譜區(qū)，具有潛在的樣品信息，但一般須經(jīng)光譜預(yù)處理后方可選用。

將樣品進(jìn)行近紅外漫反射掃描獲得樣品原始平均光譜。樣品經(jīng)不同預(yù)處理后對不同波段進(jìn)行優(yōu)化選擇，其中6101.9～4246.7cm-1波段光譜其譜線高度有較大差異，隨厚度增大，吸光度有規(guī)律的增大，故選擇該波段作為建模波段。NIRS采集過程中，由于受樣品的均勻性、外觀狀態(tài)、儀器狀態(tài)及外界等因素的影響，往往會導(dǎo)致光譜基線發(fā)生漂移與偏移。而本實驗采用一階導(dǎo)數(shù)法對光譜進(jìn)行預(yù)處理，消除了樣品表面不均勻所帶來的基線漂移，還可以起到一定的放大和分離重疊信息的作用，有利于建模。但噪聲信號也同時被放大，須對光譜進(jìn)行適當(dāng)?shù)钠交幚恚蕴岣咝旁氡龋瑴p少隨機(jī)噪音［15］。但過度的平滑則可導(dǎo)致圖譜失真，本實驗對常用的平滑點(diǎn)數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)比較最終選擇平滑點(diǎn)數(shù)為17。此外，仍須對光譜進(jìn)行SNV處理以消除固體顆粒大小、表面散射以及光程變化對近紅外漫反射光譜的影響［16］。最終，在波數(shù)位于6101.9～4246.7cm-1內(nèi)，通過一階導(dǎo)數(shù)+SNV（17平滑點(diǎn)）預(yù)處理后，利用OPUS自帶軟件建立定量模型，所建模型的主因子數(shù)為7時，決定系數(shù) R2=0.9330、RMSECV=1.34，偏移為 0.00143，RPD=3.72均達(dá)到最優(yōu)組合。

3.3 模型驗證

本預(yù)測模型分別經(jīng)內(nèi)部驗證和驗證集校正，實驗結(jié)果表明樣品衣膜真實值與預(yù)測值之間擬合的線性方程呈顯著性，存在良好的線性關(guān)系。即NIRS定量模型能在一定程度上預(yù)測未知樣品的厚度。因此，本文近紅外光譜定量模型能夠較好預(yù)測健胃消食片薄膜衣厚度，從而可以快速判斷薄膜包衣終點(diǎn)，為健胃消食片薄膜包衣終點(diǎn)在線檢測技術(shù)研究提供基礎(chǔ)。

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