利用NSCLC 患者ROSE 細胞學制片進行EGFR、KRAS、PIK3CA 基因檢測可行性的研究

胥京京，馮靖，曹潔

目前，肺癌的發病率和病死率居于所有惡性腫瘤之首［1-3］。由于肺癌早期癥狀隱匿，約70%患者確診時已處于疾病晚期，大多數已經錯失了外科手術機會［4-5］。晚期肺癌患者 5年生存率僅為17.7%［6］。近年來，靶向藥物的出現為晚期非小細胞肺癌（NSCLC）患者提供了一種新的治療手段，而腫瘤細胞基因突變的檢測結果也成為了指導晚期NSCLC患者個體化治療的重要依據［7］。目前大多數國內外機構主要利用NSCLC患者組織學標本進行基因突變檢測，但在一些特殊情況下，例如鉗夾病灶時大量出血不能繼續取材，因而無法取到足夠的組織標本、經支氣管鏡針吸活檢（TBNA）獲取的組織標本量小，現有的組織學標本僅夠用于病理診斷而無法繼續進行基因檢測，因此積極探索NSCLC可替代標本進行基因檢測具有重要的臨床意義。本研究旨在探討應用氣管鏡取材過程中現場制做的快速現場評價（ROSE）細胞學制片（ROSE細胞學標本）作為基因檢測替代標本，利用xTAG70plex液相芯片技術對其進行表皮生長因子受體（EGFR）、KRAS和PIK3CA基因突變檢測是否具有可行性。

1 對象與方法

1.1 對象 連續納入2016年6月—2017年6月就診于天津醫科大學總醫院行支氣管鏡檢查并經最終病理診斷為NSCLC的患者，嚴格按照納入標準和排除標準，共收集75例組織學標本和ROSE細胞學制片配對的病例，男33例，女42例，平均年齡（58.84±11.01）歲。其中49例標本來自肺原發病灶的肺活檢（TBLB），5例來自黏膜活檢（EBB），21例來自縱隔淋巴結穿刺活檢（TBNA）。組織學病理根據WHO 2015分類，分為61例腺癌，14例鱗狀細胞癌；TNM分期：Ⅲa期12例，Ⅲb期24例，Ⅳ期39例。本研究已獲得醫院倫理委員會批準。納入標準：（1）經氣管鏡行TBLB、EBB或者TBNA獲得組織學標本者。（2）組織學標本經病理診斷為NSCLC。（3）每例患者術中均制作了ROSE細胞學制片。（4）告知患者研究事項并簽署知情同意書。排除標準：（1）病理學診斷為小細胞肺癌或組織學病理診斷分類不清者。（2）有嚴重心、肺、腦等疾病不能耐受手術者。（3）凝血功能嚴重障礙者。（4）未制作ROSE細胞學制片者。

1.2 主要試劑與設備 迪夫快速細胞染色液A、B液（珠海貝索生物技術有限公司）；活檢鉗（JHY-FB-18-105-O-OA1，常州市久虹醫療器械有限公司）；王氏組織穿刺針（MW-319，美國ConMed公司）；常規支氣管鏡（外徑5.5 mm，BFF260）、超細支氣管鏡（外徑 4 mm，BF-P-260F）、虛擬支氣管鏡導航軟件（DirectPath V1.02，Cybernet Systems）、內鏡超聲系統（MAJ-935）、外部直徑為1.4 mm的20 MHz腔內超聲探頭（UM-S20-17S）和引導鞘套裝（K201/K203）、顯微鏡（CX31）、解剖顯微鏡（SZX7）均購自奧林巴斯公司；基因組DNA抽提試劑盒（NucleoSpin Blood，吉泰生物）；液相芯片試劑盒購自益善生物技術股份有限公司；液相基因芯片系統購自美國Luminex公司。

1.3 方法

1.3.1 獲取組織學標本 患者術前禁食水6 h，確保術前7 d內沒有使用抗凝血藥物，給予2%利多卡因5 mL霧化吸入20 min，患者取仰臥位，經鼻導管給氧，檢測血壓、心率和血氧飽和度。氣管鏡經鼻腔進入主支氣管，根據每位患者病灶部位、淋巴結的轉移情況，依據ROSE的診斷性介入肺臟病學標準取材技術以及常規 TBNA技術［8-9］，選擇性地采用TBLB、EBB、TBNA獲取組織學標本，在保證患者安全的情況下，盡可能多地取得組織學標本，獲取的組織學標本分別送病理學檢查及裝于EP管中置于-80℃冰箱保存。

1.3.2 ROSE細胞學制片 依據ROSE的臨床實施指南［10］，用2.5 mL的一次性注射器針頭將僅有的極少的組織粒從活檢鉗鉗杯中挑起，或從組織針尖端推出，在無菌細胞學專用玻片染色端自內向外涂出厚薄均勻、直徑約1 cm的圓形，空氣中晾干后將涂片依次放入迪夫快速細胞學染色液A、B液中完成ROSE染色，1名經驗豐富的細胞學醫師立即于顯微鏡下觀察細胞成分、形態及細胞背景、挑揀并確保送檢的ROSE細胞學制片上具有足夠的腫瘤細胞進行基因檢測，在ROSE細胞學制片上當腫瘤細胞數量大于總細胞數量的50%判斷為腫瘤細胞數量足夠用于EGFR、KRAS和PIK3CA基因檢測。ROSE細胞學制片在常溫干燥的環境下即可保存。每位患者至少制作出2張ROSE細胞學制片。

1.3.3 DNA提取 在解剖顯微鏡下將ROSE細胞學制片上藍色深染的腫瘤細胞用手術刀片刮下，分離出腫瘤細胞；DNA提取按照DNA抽提試劑盒說明書操作，經過裂解、消化、純化后，把上面裝有絮狀DNA無水乙醇溶液的離心管離心5 min，離心速率13 000 r/min。棄去上層液，留下DNA沉淀。吸取950μL 70%乙醇至上面有DNA沉淀的離心管中，輕輕翻轉2次，120 r/min離心5 min，棄去上層液。離心管放置數分鐘，使管內乙醇蒸發干凈。吸取30～100μL保存液到上面附著DNA的離心管中（保存液的量根據組織大小而定），輕輕拍打，使附在管壁上的DNA彌散到保存液中，先置于室溫10 min，加速DNA溶解，再4℃保存。

1.3.4 EGFR、KRAS和PIK3CA基因突變檢測 xTAG70plex液相芯片檢測EGFR、KRAS和PIK3CA基因突變操作按照益善基因突變檢測試劑盒說明書檢測。主要包括以下5個步驟：（1）多重PCR獲得各基因外顯子上含有常見等位基因型的基因片段。（2）核酸外切酶酶切及堿性磷酸酶（EXOSAP）水解，去除多余的引物和dNTP。（3）等位基因特異性引物延伸（allele specific primer extension，ASPE）反應。（4）ASPE引物上的Tag序列與聚苯乙烯微球上的Anti-Tag序列特異結合，即雜交反應。（5）雜交后的微球通過Luminex 200多功能流式點陣儀分析，讀取每個樣品的中位熒光值。以組織學標本檢測所得結果為金標準。在這75例患者中，由于PIK3CA檢出率過低（1/75，1.3%），無法進行相關比較，筆者僅對EGFR和KRAS進行相關比較。

1.4 統計學方法 應用SPSS 21.0軟件進行分析，計數資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。計算ROSE細胞學標本配對組織學標本基因突變敏感度、特異度、一致率。

Tab.1 The comparision of KRAS mutation results between ROSE cytology group and histology group表1 組織學標本與ROSE細胞學標本KRAS基因突變比較 （例）

2 結果

2.1 ROSE鏡下表現 典型的肺腺癌在光學顯微鏡下表現為癌細胞嗜堿呈藍色深染，體積較大，呈圓形或類圓形，密集成團分布，呈桑葚樣排列，胞漿豐富，可有空泡，呈高分泌樣，見圖1。典型的肺鱗狀細胞癌在光學顯微鏡下表現為癌細胞形狀不規則、大小不一、呈多角形，胞漿角化，部分少漿、裸核，細胞核大小不規則，畸形明顯，見圖2。肺鱗癌ROSE細胞學制片壞死背景明顯，可見紅細胞、炎細胞、壞死細胞殘片，如有感染可見中性粒細胞。

Fig.1 Pictures showing typical adenocarcinoma from ROSE cytological slides圖1 典型肺腺癌ROSE細胞學制片在光學顯微鏡下表現

Fig.2 Pictures showing typical spuamous cell carcinoma from ROSE cytological slides圖2 典型肺鱗狀細胞癌ROSE細胞學制片在光學顯微鏡下表現

2.2 組織學標本與配對ROSE細胞學標本基因突變一致性分析 75例患者中36例在組織學標本和配對ROSE細胞學標本中同時檢測出了相同的EGFR突變類型：23例 L858R突變，11例E746_A7501缺失，1例 L861Q突變，1例L747_P735突變，EGFR突變檢出一致率為100%。6例在組織學標本配對ROSE細胞學標本中同時檢測出了相同的KRAS突變類型：4例G12V突變，2例G12C突變；1例在組織學標本中檢測出KRAS突變（G12V突變），而在配對的ROSE細胞學標本中沒有檢測出KRAS突變，ROSE細胞學敏感度85.7%，特異度100%，一致率98.7%，見表1；1例在組織學標本配對ROSE細胞學標本中同時檢測出了相同的PIK3CA突變類型（E545K突變）。

2.3 ROSE細胞學標本EGFR基因突變與臨床特征的關系 在組織學標本配對ROSE細胞學標本中同時檢測出了相同的EGFR突變類型的36例中，EGFR基因突變高發于女性、非吸煙者和肺腺癌者（均P＜0.05），見表 2。

Tab.2 EGFR mutation and clinical characteristics in ROSE cytology group表2ROSE細胞學標本EGFR基因突變與臨床特征的關系例（%）

3 討論

隨著基因檢測技術的不斷發展，細胞學標本的獲取對于肺癌患者具有越來越重要的意義，因為細胞學標本獲取簡單、創傷小，特別是對已經失去手術機會的晚期肺癌患者，獲取腫瘤組織的細胞學標本可以避免外科手術風險、減輕患者痛苦。已有學者對細胞學標本比如肺泡灌洗液、胸水、外周血、針吸細胞懸液等進行基因突變檢測的報道［11-16］，但少有將ROSE細胞學制片作為細胞學標本應用于基因檢測的報道。在診斷性介入肺臟病學操作中，ROSE細胞學制片具有制作簡單、制作所需時間短、易于保存、保存時間久等優點，但其最主要的優點是可以聯合快速現場評價技術提供標本細胞分類和細胞數量的實時反饋。本實驗創新性地應用NSCLC患者行氣管鏡檢查時現場制作的ROSE細胞學制片作為細胞學標本進行EGFR、KRAS和PIK3CA基因突變檢測，對比配對的組織學標本基因檢測的結果，探究ROSE細胞學制片作為細胞學標本進行EGFR、KRAS和PIK3CA基因突變檢測的可行性。

本研究中，有1例組織學標本檢測出KRAS基因突變而在ROSE細胞學標本中沒有檢出，筆者推測這1例ROSE細胞學制片基因突變檢測結果假陰性可能為ROSE細胞學制片上腫瘤細胞數量不足、刮取下來的腫瘤細胞中混雜有正常細胞（比如炎癥細胞、類上皮細胞）導致。

常規的基因檢測方法如直接測序法、擴增阻滯突變系統（ARMS）、聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性（PCR-SSCP）等技術由于敏感度不足等問題在細胞學標本檢測基因突變應用中受限，對于細胞數量確實很少的細胞學標本，可以使用敏感性更高的檢測方法，本實驗采用的xTAG70plex液相芯片技術有檢測樣本多樣性、所需樣本量少、敏感性高、特異性強、檢測速度快及檢測方便等優勢［17］，但xTAG70plex液相芯片技術對于細胞學標本中腫瘤細胞的數量尚無統一要求。Bozzetti等［18］指出當使用直接測序法檢測基因突變時，吉姆薩染色制片上腫瘤細胞數量＞50%總細胞數量（即相當于至少300個腫瘤細胞，DNA產量范圍為30～140 ng）判斷為細胞數量足夠用于 EGFR、KRAS 基因檢測。Jain 等［12］發現在DNA提取過程中將蛋白酶K孵育時間延長至2 h可以提高DNA產量。目前關于細胞學標本基因突變檢測腫瘤細胞數量標準的文獻較少。為了避免分子檢測假陰性結果，應取得盡可能多的腫瘤細胞。這就需要支氣管鏡操作者對腫瘤的準確定位，除了支氣管鏡下直接可見的腫物外，還需要聯合采用支氣管內超聲引導（EBUS）、磁導航、電子虛擬導航或者超聲探頭等輔助方法以幫助操作者準確到達病灶取材，以取到盡可能多的腫瘤組織。另外，制作出高質量的ROSE細胞學制片以保留盡可能多的腫瘤細胞也很重要，比如涂片應厚薄均勻以減少細胞重疊、涂片經空氣晾干后應盡快放入染缸中染色以防止細胞溶解、及時更換染液以達到良好的染色效果等，而且良好的制片也有助于細胞病理學家對制片的判讀以指導氣管鏡準確取材。

另外ROSE細胞學制片可以“一片兩用”，在一些特殊的情況下，患者行氣管鏡檢查取材時，鉗夾或穿刺病灶時大量出血或其他特殊情況不能繼續取材（例如出血風險極高、存在氣胸風險、患者極度不配合要求終止操作等）而無法取到足夠的組織標本用于病理學診斷和基因檢測時，獲取的少量組織學標本可以用于制作ROSE細胞學制片，繼而送檢細胞病理學診斷，用于診斷的ROSE細胞學制片在細胞病理學診斷后可以嘗試繼續用于基因檢測，患者不僅可以避免再次行活檢取材的風險，也能盡快得到疾病的診斷和及時的治療。

多項研究發現，NSCLC患者EGFR基因突變高發于女性、非吸煙、肺腺癌患者，且這類NSCLC患者對靶向藥物吉非替尼反應較好［12，16，19］，本實驗同樣發現在ROSE細胞學標本中，EGFR基因突變在女性、肺腺癌和非吸煙者中檢出率較高。

xTAG70plex液相芯片技術可以有效地檢測ROSE細胞學標本EGFR、KRAS和PIK3CA的基因突變狀態，xTAG70plex液相芯片技術檢測ROSE細胞學標本和配對的組織學標本基因突變結果高度一致。因此，對于NSCLC患者，ROSE細胞學制片可以作為組織學替代標本進行基因檢測，并且此方法特別適用于沒有多余組織學標本進行基因檢測的晚期NSCLC患者，具有較高的臨床價值。

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