TEM-1型β-內酰胺酶及CarO 蛋白介導的耐舒巴坦鮑曼不動桿菌臨床株耐藥機制研究

李楠，張豪杰，王悅，祁萌，郭文學，王哲，祁偉

鮑曼不動桿菌屬非發酵糖的革蘭陰性桿菌，是醫院感染的重要條件致病菌之一，可引起廣泛的院內感染，包括尿路感染、術后感染、菌血癥、腦膜炎及呼吸機相關性肺炎等［1］。該菌耐藥嚴重，2000年后，鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率迅速上升，臨床上常將舒巴坦作為治療耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌的重要藥物之一［2-3］。然而，鮑曼不動桿菌對舒巴坦的耐藥率也在逐年增加［4-5］，這無疑進一步加大了抗感染治療難度。TEM-1型β-內酰胺酶及CarO蛋白是介導鮑曼不動桿菌對舒巴坦耐藥的重要機制，本研究采用實時熒光定量RT-PCR技術，檢測TEM-1型β-內酰胺酶編碼基因blaTEM-1及carO基因mRNA相對表達量，探討TEM-1型β-內酰胺酶及CarO蛋白在耐舒巴坦鮑曼不動桿菌臨床株中所起作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源及分組 篩選來自2013年1月—2015年6月天津市某三甲綜合醫院患者呼吸道、尿道分離出的鮑曼不動桿菌臨床株24株。全部臨床株經生化鑒定。通過藥敏試驗分為舒巴坦非敏感組（耐藥12株，中介6株）和敏感組（6株）。

1.1.2 主要儀器與試劑 PCR儀（德國Eppendorf公司），DYY-6D型電泳儀（北京六一儀器廠），Line-gene Real-Time PCR Detection System（杭州博日科技有限公司），GEL-DOC-200型凝膠成像系統（美國BIO-RAD公司）。抗生素藥敏紙片購自天津市金章科技有限公司；舒巴坦鈉（SUL）標準品購買于中國食品藥品檢定研究院。DNA聚合酶、引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。EASY spin Plus細菌RNA快速提取試劑盒（PN43）購自中國北京艾德萊生物科技有限公司；焦磷酸二乙酯（DEPC）購自 BBI公司。Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（k1622）購自Thermo科技有限公司，BioEasy Master Mix（SYBR Green）購自博日科技有限公司。基因測序委托北京擎科新業生物技術有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 體外藥敏試驗 采用瓊脂稀釋法測定菌株對舒巴坦鈉標準品的最低抑菌濃度（MIC）。折點判定標準參考文獻［6］，≤4 mg/L 為敏感（S），8 mg/L 為中介（I），≥16 mg/L為耐藥（R）。采用紙片擴散法（Kirby-Bauer，K-B）測定菌株對頭孢哌酮（CFP）、美羅培南（MEM）、亞胺培南（IMP）、環丙沙星（CIP）、慶大霉素（GEN）、氨芐西林（AMP）等藥物的敏感性。依據美國臨床實驗室標準委員會（CLIS）2016年頒布的準則判讀。質控菌株為ATCC29522和ATCC27853。

1.2.2 基因擴增 細菌總DNA提取采用煮沸法。BlaTEM-1基因引物參考文獻［7］，carO基因引物使用Primer 5.0軟件自行設計，引物序列見表1。PCR反應條件：預變性94℃5min；變性 94 ℃ 60 s，退火 50 ℃ 60 s，延伸 72 ℃ 60 s，32 個循環；72℃充分延伸8 min。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳，GEL-DOC-200凝膠成像系統照相觀察結果。挑選4株blaTEM-1陽性菌株（A3、A5、1327、C1），對其擴增產物進行測序，經BLAST軟件比對。

1.2.3 實時熒光定量RT-PCR 細菌總RNA提取、cDNA合成、RT-PCR反應均按照相應試劑盒說明書進行。RT-PCR反應條件：預變性95℃1 min；變性95℃15 s，退火60℃15 s，延伸72℃30 s，30個循環。BlaTEM-1基因引物使用Primer 5.0自行設計，carO基因、內參基因rpoB引物參考文獻［8-9］。引物序列見表 1。采用 2-ΔΔCt法計算 carO 及 blaTEM-1mRNA相對表達量。每株菌株重復檢測3次，取均值。

Tab.1 The sequence of primer表1 引物序列

1.3 統計學方法 使用SPSS 21.0軟件分析數據。不符合正態分布計量數據用中位數（四分位數間距）［M（Q）］表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；相關性檢驗采用Spearman秩相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥敏試驗結果 24株鮑曼不動桿菌臨床株不同組別對6種常用抗生素藥敏結果、對舒巴坦的MIC值及判定結果見表2、3。

Tab.2 The results of drug susceptibility表2 藥敏試驗結果

2.2 基因擴增結果 非敏感組中除B1、B2外全部攜帶blaTEM-1基因，敏感菌株均未檢測到blaTEM-1基因，見圖1；24株鮑曼不動桿菌全部擴增出carO基因，見圖 2。選取的 A3、A5、1327、C1 臨床株，其blaTEM-1基因序列與 GenBank中給出 blaTEM-1基因（JQ670906）同源性為99%，經Blastx比對，未出現氨基酸替代，見圖3。經BLAST軟件分析測序結果，C1 啟動子為 P3，A3、A5、1327 啟動序列-10 區第162位堿基由G→T，突變為P4啟動子。

Tab.3 The MIC values of sulbactam and the mRNA expression levels of blaTEM-1and carO genes表3 舒巴坦的MIC值及blaTEM-1、carO基因mRNA表達

Fig.1 PCR amplification of blaTEM-1gene圖1 blaTEM-1基因擴增產物電泳圖

Fig.2 PCR amplification of carO gene圖2 carO基因擴增產物電泳圖

Fig.3 The Blastx comparison of blaTEM-1gene clinical strains of A3,A5,1327 and C1圖3 A3、A5、1327、C1臨床株blaTEM-1Blastx比對圖

2.3 RT-PCR結果 基因擴增熔解曲線為單峰，見圖 4、5，為特異性擴增，carO及blaTEM-1基因mRNA相對表達量結果，見表3。16株blaTEM-1陽性菌株blaTEM-1基因 mRNA 表達波動于 0.323～6.761，M（Q）為 1.067（0.644），舒巴坦 MIC 波動于 8～64 mg/L，M（Q）為 32（56）；16株 blaTEM-1陽性菌株舒巴坦 MIC 值與blaTEM-1基因mRNA相對表達量呈中度正相關（rs=0.551，P=0.027）。非敏感組carO基因mRNA相對表達量波動于 0.253～10.360，M（Q）為 1.216（1.133），敏感組臨床株carO基因mRNA相對表達量波動于0.410～3.125，M（Q）為 0.983（3.344），2 組間 carO 基因mRNA相對表達量差異無統計學意義（Z=0.167，P=0.868）。

Fig.4 Melting curve of carO gene圖4 carO基因熔解曲線

Fig.5 Melting curve of blaTEM-1gene圖5 blaTEM-1基因熔解曲線

3 討論

鮑曼不動桿菌是醫院內感染常見的病原菌，耐藥嚴重。2005—2014年CHINET中國細菌耐藥性監測發現，鮑曼不動桿菌在大型三甲醫院的分離率逐漸升高，且對青霉素、頭孢菌素類普遍耐藥，2014年對碳青霉烯類耐藥率達60%以上，但是對環丙沙星、慶大霉素、頭孢哌酮/舒巴坦有較好的敏感性［4］。湖南湘雅醫院2015年鮑曼不動桿菌臨床株對環丙沙星、頭孢曲松、亞胺培南耐藥率均達80%以上［10］。羅馬尼亞有報道，鮑曼不動桿菌感染后抗生素治療失敗率僅次于銅綠假單胞菌［11］。本研究中鮑曼不動桿菌臨床株耐藥嚴重，但是對碳青霉烯類耐藥率低于上述報道，而對環丙沙星、慶大霉素耐藥性高于上述報道，這可能與當地抗生素使用特點有關；其次本研究樣本量較小，且菌株經過篩選，缺乏代表性。但是，6株敏感菌株中5株對頭孢哌酮或氨芐西林耐藥，2株對碳青霉烯類耐藥，這顯示了當鮑曼不動桿菌對普通β-內酰胺甚至碳青霉烯類藥物耐藥時，對舒巴坦可能仍有較好的敏感性，這支持臨床上應用舒巴坦治療多重耐藥鮑曼不動桿菌［2-3］。然而，鮑曼不動桿菌舒巴坦的敏感性逐年下降，其耐藥機制也成為研究熱點。

產生β-內酰胺酶是大多數細菌對β-內酰胺類抗生素主要耐藥機制之一。TEM-1是革蘭陰性菌中最常見的β-內酰胺酶，不僅導致細菌對傳統β-內酰胺類抗生素耐藥，甚至參與細菌對含酶抑制劑的復合物的耐藥機制。早在1995年，Joly-Guillou等［12］報道產TEM-1型β-內酰胺酶鮑曼不動桿菌對舒巴坦的MIC值較不產者高。本研究6株敏感株blaTEM-1均陰性，18株非敏感株中16株blaTEM-1陽性，且blaTEM-1陽性菌株的舒巴坦MIC值與blaTEM-1基因mRNA相對表達量呈中度正相關，提示鮑曼不動桿菌TEM-1型β-內酰胺酶表達越高其對舒巴坦的MIC值越高，與以往研究結果相似［6］。這可能與舒巴坦和β-內酰胺酶間的作用機制有關。TEM-1的絲氨酸活性中心位于ɑ螺旋H2的N端，其邊緣為一氧負離子穴，舒巴坦靠氧負離子穴和Arg244的吸引作用與β-內酰胺酶結合，然后酶的絲氨酸活性基團攻擊舒巴坦內酰胺環的羧基碳，舒巴坦的五元環被打開，在此過程中，舒巴坦被消耗［13-15］。然而，本研究中還發現2株對舒巴坦耐藥但是blaTEM-1陰性菌株，這可能與鮑曼不動桿菌耐藥機制復雜，可能存在本研究未涉及的耐藥機制有關，如青霉素結合蛋白表達減低或變異，可導致舒巴坦不能與鮑曼不動桿菌的青霉素蛋白結合或結合力減低［16］，或產生頭孢菌素酶-30［17］等，從而不能對其起殺菌作用。

BlaTEM-1基因表達受多種機制調控，其中啟動子調控為重要機制之一。國外學者曾報道blaTEM-1型基因啟動子主要有 P3、Pa/Pb、P4、P5四型，其中 P3為弱啟動子，Pa/Pb、P4、P5 為強啟動子［18］。本實驗中攜帶強啟動子菌株blaTEM-1mRNA表達均高于攜帶弱啟動子菌株，與文獻［6，18］研究結果相似，提示啟動子可能是介導blaTEM-1mRNA高表達的機制之一。在blaTEM-1基因的基礎上發生一個或數個點突變，可突變成為編碼耐酶抑制劑（inhibitor-resistant TEM，IRT）的基因。IRT不受酶抑制劑影響，是細菌對含酶抑制劑復合物抗生素（主要是阿莫西林/克拉維酸）耐藥的重要原因。但IRT介導的耐藥機制主要在歐洲報道［19］，我國尚未見報道。本研究4株測序菌株，也未發現IRT，考慮blaTEM-1基因突變在鮑曼不動桿菌對舒巴坦耐藥機制中少見。

CarO蛋白作為通道蛋白，可攝取小分子水溶性物質，如亞胺培南、鳥氨酸、絲氨酸及賴氨酸等［20］。而舒巴坦作為水溶性小分子物質，理論上可以通過CarO通道。本研究發現carO基因mRNA相對表達量在非敏感組與敏感組間表達無差異，與吳萌萌等［21］報道結果不同。基因表達和翻譯水平也受多種機制調節，CarO蛋白表達是否參與鮑曼不動桿菌對舒巴坦耐藥機制，還需做進一步驗證。

綜上所述，本研究中鮑曼不動桿菌臨床受試株耐藥嚴重，其對舒巴坦的主要耐藥機制與TEM-1型β-內酰胺酶高表達有關，而啟動子調控可能是blaTEM-1基因mRNA高表達的原因之一。

［1］Perez F，Hujer AM，Hujer KM，et al.Global challenge of multidrugresistantAcinetobacterbaumannii［J］. Antimicrob Agents Chemother，2007，51（10）：3471-3484.doi：10.1128/AAC.01464-06.

［2］Sun L，Wang X，Li Z.Successful treatment of multidrug-resistantAcinetobacter baumanniimeningitis with ampicillin sulbactam in primary hospital［J］.Br J Neurosurg，2017：1-4.doi：10.1080/02688697.2017.1319907.

［3］Chen H，Liu Q，Chen Z，et al.Efficacy of sulbactam for the treatmentofAcinetobacterbaumanniicomplex infection：A systematic review and meta-analysis［J］.J Infect Chemother，2017，23（5）：278-285.doi：10.1016/j.jiac.2017.01.005.

［4］胡付品.2005—2014年CHINET中國細菌耐藥性監測網5種重要臨床分離菌的耐藥性變遷［J］.中國感染與化療雜志，2017，17（1）：93-99.Hu FP.Resistance trends among clinical isolates in China reported from CHINET surveillance of bacterial resistance，2005 – 2014［J］.Chinese Journal of Infection and Chemotherapy，2017，17（1）：93-99.doi：10.16718/j.1009-7708.2017.01.016.

［5］張輝，張小江，徐英春，等.2005—2014年CHINET不動桿菌屬細菌耐藥性監測［J］.中國感染與化療雜志，2016，16（4）：429-436.Zhang H，Zhang XJ，Xu YC，et al.Resistance profile ofAcinetobacterisolates in hospitals across China：results from CHINET Antimicrobial Resistance Surveillance Program 2005-2014［J］.Chinese Journal of Infection and Chemotherapy，2016，16（4）：429-436.doi：10.16718/j.1009-7708.2016.04.010.

［6］Krizova L，Poirel L，Nordmann P，et al.TEM-1 beta-lactamase as a source ofresistance to sulbactam in clinicalstrainsofAcinetobacter baumannii［J］.J Antimicrob Chemother，2013，68（12）：2786-2791.doi：10.1093/jac/dkt275.

［7］Waltner-Toews RI，Paterson DL，Qureshi ZA，et al.Clinical characteristics ofbloodstream infections due to ampicillinsulbactam-resistant，non-extended-spectrum-beta-lactamaseproducingEscherichia coliand the role of TEM-1 hyperproduction［J］.Antimicrob Agents Chemother，2011，55（2）：495-501.doi：10.1128/AAC.00797-10.

［8］Fonseca EL，Scheidegger E，Freitas FS，et al.CarbapenemresistantAcinetobacter baumanniifrom Brazil：role of carO alleles expression and blaOXA-23 gene［J］.BMC Microbiol，2013，13：245.doi：10.1186/1471-2180-13-245.

［9］Rosenfeld N，Bouchier C，Courvalin P，et al.Expression of the resistance-nodulation-cell division pump AdeIJK in Acinetobacter baumannii is regulated by AdeN，a TetR-type regulator［J］.Antimicrob Agents Chemother，2012，56（5）：2504-2510.doi：0.1128/AAC.06422-11.

［10］孫謙，劉培，屈青云.湘雅醫院臨床分離鮑曼不動桿菌耐藥變遷及臨床分布特征［J］.現代檢驗醫學雜志，2017，32（3）：67-70.Sun Q，Liu P，Qu QY.Clinical distribution and resistant transition of clinical isolatedAcinetobacter Baumanin Xiangya Hospital［J］.Journal of Modern Laboratory Medicine，2017，32（3）：67-70.doi：10.3969/j.issn.1671-7414.2017.03.018.

［11］Penes NO，Muntean AA，Moisoiu A，et al.An overview of resistance profiles ESKAPE pathogens from 2010-2015 in a tertiary respiratory center in Romania［J］.Rom J Morphol Embryol，2017，58（3）：909-922.

［12］Joly-Guillou ML，Decre D，Herrman JL，et al.Bactericidal in-vitro activity of beta-lactams and beta-lactamase inhibitors，alone or associated，against clinical strains ofAcinetobacter baumannii：effect of combination with aminoglycosides ［J］.J Antimicrob Chemother，1995，36（4）：619-629.

［13］Heidari-Torkabadi H，Bethel CR，Ding Z，et al."Mind the Gap"：Raman evidenceforrapid inactivation ofCTX-M-9 beta-Lactamase using mechanism-based inhibitors that bridge the active site［J］.J Am Chem Soc，2015，137（40）：12760-12763.doi：10.1021/jacs.5b10007.

［14］LiR，WangYT，Chen CL.Computermodelingon the tautomerization ofsulbactam intermediate in SHV-1 betalactamases：E166A mutant vs.wild type［J］.J Mol Graph Model，2013，40：131-139.doi：10.1016/j.jmgm.2012.12.002.

［15］Shapiro AB.Kinetics of Sulbactam hydrolysis by beta-lactamases，and kinetics of beta-lactamase inhibition by sulbactam ［J］.Antimicrob Agents Chemother，2017，61（12）.pii：e01612-17.doi：10.1128/AAC.01612-17.

［16］PenwellWF，ShapiroAB，GiacobbeRA，etal.Molecular mechanisms of sulbactam antibacterial activity and resistance determinants inAcinetobacter baumannii［J］.Antimicrob Agents Chemother，2015，59（3）：1680-1689.doi:10.1128/AAC.04808-14.

［17］Kuo SC，Lee YT，Lauderdale TL，etal.Contribution of Acinetobacter-derived cephalosporinase-30 to sulbactam resistance inAcinetobacter baumannii［J］.Front Microbiol，2015，6：231.doi：10.3389/fmicb.2015.00231.

［18］Lartigue MF，Leflon-Guibout V，Poirel L，et al.Promoters P3，Pa/Pb，P4，and P5 upstream from bla（TEM）genes and their relationship to beta-lactam resistance［J］.Antimicrob Agents Chemother，2002，46（12）：4035-4037.

［19］Kaye KS，Gold HS，Schwaber MJ，et al.Variety of beta-lactamases produced by amoxicillin-clavulanate-resistantEscherichia coliisolated in the northeastern United States［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48（5）：1520-1525.

［20］Zahn M，D'Agostino T，Eren E，et al.Small-molecule transport by CarO，an abundant eight-stranded beta-barrel outer membrane protein fromacinetobacter baumannii［J］.J Mol Biol，2015，427（14）：2329-2339.doi:10.1016/j.jmb.2015.03.016.

［21］吳萌萌，徐家根，梅亞寧.鮑曼不動桿菌細胞內的舒巴坦濃度與外膜蛋白表達相關性研究［J］.中國臨床藥理學雜志，2016，32（20）：1897-1900.Wu MM，Xu JG，Mei YN.Correlation between intracellular sulbactam concentration and expression of outer membrane protein inAcinetobacter baumannii［J］.Chin J Clin Pharmacol，2016，32（20）：1897-1900.doi：10.13699/j.cnki.1001-6821.2016.20.019.